正交試驗優化谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工藝

李向紅，周小玲，劉永樂*，俞 健，王發祥，王建輝

(長沙理工大學食品與生物工程系，湖南 長沙 410114)

正交試驗優化谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工藝

李向紅，周小玲，劉永樂*，俞 健，王發祥，王建輝

(長沙理工大學食品與生物工程系，湖南 長沙 410114)

研究谷氨酰胺酶對米谷蛋白改性的工藝。以脫酰胺度、溶解度為考察指標進行了工藝條件的優化，探討谷氨酰胺酶與米谷蛋白質量比、反應溫度、反應pH值3個工藝參數對改性米谷蛋白溶解度及脫酰胺度的影響，確定了谷氨酰胺酶改性最佳工藝條件，用正交試驗法對米谷蛋白酶法改性工藝條件進行了優化，得到最佳工藝條件為：谷氨酰胺酶與米谷蛋白的質量比1:7、酶解脫酰胺改性的反應溫度37.0℃、時間24h、pH7.0。優化后的米谷蛋白脫酰胺度為52.76%，溶解度為93.78%。

米谷蛋白；蛋白質谷氨酰胺酶；脫酰胺

大米是大多數人類的能量和蛋白來源[1]，大米蛋白具有無色、味道溫和、必需氨基酸含量豐富、低過敏性及低膽固醇等特點[2]，是谷物蛋白中營養價值較高的一種。但是，大米蛋白質富含谷氨酰胺及天冬酰胺，酰胺基之間通過氫鍵等結合使蛋白質聚集沉淀，導致其溶解度較低，限制其在液態食品及飲料中的應用；低溶解度也會影響蛋白質的其他功能性質例如起泡性、乳化性及凝膠性等[3]。

研究表明通過對蛋白質脫酰胺改性能改善其溶解性及其他功能性質[4-8]，酸法、酶法已廣泛應用于小麥、玉米和大米等蛋白的脫酰胺[9-12]，但這些方法存在的問題是會帶來肽鏈的水解或作用底物有限等[13-15]。目前有研究發現，蛋白質谷氨酰胺酶應用于小麥蛋白及玉米醇溶蛋白的脫酰胺中可顯著提高其溶解度和乳化性[10-11]并不會引起肽鏈的水解；將其用于干酪素的脫酰胺的研究發現蛋白質谷氨酰胺酶主要酶解分子質量高的蛋白質，而不是分子質量小的肽或是降解后的短肽[16]。但目前未見有將蛋白質谷氨酰胺酶應用于大米蛋白脫酰胺改性的研究報道。米谷蛋白中富含谷氨酰胺殘基，本課題組前期研究發現可以使用蛋白質谷氨酰胺酶對其進行脫酰胺改性，本實驗研究了酶解米谷蛋白的工藝流程及其最優的酶解條件，為改性米谷蛋白尋找了新途徑，對于擴大大米蛋白在食品工業中的應用范圍提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米碎米 湖南省霞凝糧庫；谷氨酰胺酶(glutaminase)美國Sigma公司；所有其他化學試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

UV2600 紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SK-1 型快速混勻器 金壇市醫療儀器廠；TGL-16B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；FD-1型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米粉的脫脂

大米粉采用正己烷在常溫下(25℃)浸提攪拌1h，料液比為1:5，漿液真空過濾后濾餅在室溫下自然干燥48h。干燥后的原料經碾磨后過200目篩，4℃保藏。

1.3.2 分步法提取米谷蛋白工藝流程

對Agboola等[17]和van der Borght等[18]提取米谷蛋白的方法進行改進后提取米谷蛋白。提取溫度為室溫，提取時間2h，離心速度3000r/min，離心時間15min。

大米粉→正己烷脫脂→室溫下自然干燥24h→蒸餾水提取清蛋白(料液比1:10)→離心→5%氯化鈉鹽溶液提取球蛋白(料液比1:10)→離心→70%乙醇溶液提取出醇溶蛋白(料液比1:5)→離心→沉淀水洗→ 0.05mol/L氫氧化鈉溶液(料液比1:10)→離心→上清液用12%的三氯乙酸溶液調節pH值至等電點4.8 → 離心→透析→冷凍干燥→產品。

1.3.3 米谷蛋白常規成分檢測

蛋白質含量的測定：采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法，氮換算為蛋白質的系數為5.95；脂肪含量的測定：采用GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》中索氏抽提法；水分含量的測定：采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥法；灰分含量的測定：采用GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》中干法灰化法。

1.3.4 谷氨酰胺酶改性米谷蛋白的工藝流程及評價方法

1.3.4.1 谷氨酰胺酶改性米谷蛋白的工藝流程

稱取定量米谷蛋白，邊攪拌邊加入盛有磷酸鹽緩沖溶液(200mmol/L，pH7.0)的恒溫酶反應器內，形成底物質量分數為1%的分散懸浮液，攪拌30min后加入一定量的谷氨酰胺酶(E/S＝1/7)進行改性反應。改性的反應溫度37℃、pH7.0、反應時間0～48h。空白實驗則以不加酶的相同濃度的蛋白質在上述相同反應條件下反應24h。反應結束后，蛋白質酶解溶液以及空白液均用0.1mol/L的醋酸溶液透析8h，然后將蛋白溶液真空凍干成固體粉末備用。

1.3.4.2 酰胺氮的檢測

樣品酰胺氮含量的檢測方法采用Conway微量彌散皿法的改進方法[19]。準確稱取0.2000g蛋白質，加入10mL 3mol/L鹽酸，密封于硬質玻璃燒瓶中，在120℃恒溫條件下水解3h，水解完畢后取出冷卻。取水解溶液做蒸餾，用4%的硼酸溶液接收釋放的氨氣。反應結束后用標準鹽酸滴定，記錄消耗的鹽酸體積。脫酰胺度(deamidation degree，DD)由脫酰胺處理后釋放的酰胺基數目與原蛋白總酰胺基數目的比值來表示[19]。計算公式如下：

CN＝N(HCl)×V(HCl)×0.014/WT

式中：CN為酰胺氮含量/(g/g蛋白質)；N(HCl)為標準鹽酸的濃度，取0.0097mol/L；V(HCl)為消耗標準鹽酸的體積/ mL；WT為樣品中蛋白質的含量/g；

1.3.4.3 溶解度的檢測

采用福林酚試劑法測定米谷蛋白及其脫酰胺樣品pH7.0的溶液中的溶解度[20]。準確稱取凍干樣品(10mg)分散于10mL緩沖溶液中，緩沖液是10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)。分散好的蛋白溶液在20℃恒溫條件下攪拌過夜，然后離心30min(3000r/min)，收集上層可溶性組分。從上述收集的溶液中取1mL用于測定蛋白質的溶解度，用牛血清白蛋白做標準曲線。

1.3.5 谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工藝條件的研究

設定溶液總體積50mL，蛋白質質量分數1%，酶與底物比(E/S)為1:7、改性溫度37℃、改性時間24h、pH7.0，固定其他條件，分別考察酶與底物比、酶解溫度、pH值對改性米谷蛋白工藝的影響。

1.3.6 正交試驗設計

根據單因素試驗確定的范圍，選擇酶與底物比、改性溫度、酸堿度(pH值)作為考察的3個因素，每個因素3個水平，以脫酰胺度值(DD)與溶解度為考察指標，用L9(34)正交試驗表安排試驗，得出最佳改性條件。

2 結果與分析

2.1 堿法提取米谷蛋白的含量檢測

提取蛋白質時，通常選擇蛋白質在等電點附近的pH值條件作為蛋白酸沉時的pH值。本研究在制備米谷蛋白時選擇pH4.8為酸沉條件，表1列出了所制備的米谷蛋白的理化性質。

表1 自提米谷蛋白的成分分析Table1 Chemical composition of laboratory prepared rice glutelin

2.2 谷氨酰胺酶改性米谷蛋白的工藝條件選擇

2.2.1 酶與米谷蛋白比(E/S)對改性米谷蛋白工藝的影響

圖1 酶與米谷蛋白比(E/S)對改性米谷蛋白脫酰胺度及溶解度的影響Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on DD and solubility of modified rice glutelin

由圖1可知，隨著谷氨酰胺酶用量的增加，米谷蛋白的脫酰胺度及溶解度逐漸增加，酶與米谷蛋白比在1/9～1/7之間時，脫酰胺度及溶解度增加很快，呈直線上升趨勢，當酶與米谷蛋白比超過1/7時，脫酰胺度及溶解度呈水平線趨勢，增長緩慢。初步確定酶與米谷蛋白比在1/7～1/5之間。

2.2.2 酶解溫度對改性米谷蛋白工藝的影響

圖2 酶解溫度對改性米谷蛋白脫酰胺度及溶解度的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on DD and solubility of modified rice glutelin

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，米谷蛋白的脫酰胺度及溶解度先上升后下降，呈“幾”字趨勢。酶解溫度在35～40℃之間，其脫酰胺度及溶解度均呈最大值，說明谷氨酰胺酶的最適反應溫度在35～40℃之間。

圖3 酸堿度對改性米谷蛋白脫酰胺度及溶解度的影響Fig.3 Effect of reaction pH on DD and solubility of modified rice glutelin

2.2.3 酸堿度(pH值)對改性米谷蛋白工藝的影響由圖3可知，酸堿度對谷氨酰胺酶改性米谷蛋白的影響很顯著。pH值為5.5～7.0時，米谷蛋白的脫酰胺度及溶解度呈較快的增長趨勢，當pH值大于7.0，呈緩慢的降低趨勢。可見谷氨酰胺酶的最適反應環境為中性環境。

2.3 谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工藝條件的優化

2.3.1 正交試驗

表2 正交試驗因素與水平表Table2 Factors and levels for orthogonal array design

根據前面的單因素試驗，確定正交試驗的因素水平，從而得出最佳改性工藝條件。正交試驗因素水平及結果分別見表2～4。

表 33 LL9((334)正交試驗設計及結果Table3 Orthogonal array design matrix and results

表4 正交試驗方差分析Table4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

從F分布表中查的F0.05(2,2)＝19.00，F0.01(2,2)＝99.00，FC＞F0.01，故因素C對試驗結果有非常顯著的影響；從脫酰胺度的方差分析結果看來FA、FB在19.00～99.00之間，故因素A、B對試驗結果有顯著影響；而從溶解度的結果看來，FA、FB小于F0.05，因素A、B對試驗結果無顯著影響。考慮到正交試驗中在E/S為1/7、37℃的條件下溶解度較高，因此選擇A3B2C2，即酶與底物比為1/7、改性溫度37℃、pH7.0為最優方案。

2.3.2 驗證實驗

采用優化后的工藝條件，改性時間24h進行3次驗證實驗，測得改性米谷蛋白脫酰胺度為52.76%，溶解度為93.78%，優于正交試驗中的任何一個組合，故確定為最優的改性工藝條件。

3 結 論

本實驗采用分步提取法制備米谷蛋白，其含量達到91.57%，以其為原料，使用谷氨酰胺酶對其進行改性。以脫酰胺度、溶解度為考察指標進行了工藝條件的優化，研究了谷氨酰胺酶-米谷蛋白質量比、反應溫度、反應pH值3個工藝參數對改性米谷蛋白溶解度及脫酰胺度的影響，確定了谷氨酰胺酶改性最佳工藝條件為：谷氨酰胺酶與米谷蛋白的質量比為1:7，酶解脫酰胺改性的反應溫度37.0℃、時間24h、pH7.0。優化后的米谷蛋白脫酰胺度為52.76%，溶解度為93.78%。因此谷氨酰胺酶適用于含有大量谷氨酰胺殘基的大米蛋白的脫酰胺改性，從而可有效改善米谷蛋白的溶解度及其他的功能性質，可達到擴大其生產應用范圍的目的。

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Orthogonal Array Design for the Optimization of Rice Glutelin Modification Using Glutaminase

LI Xiang-hong，ZHOU Xiao-ling，LIU Yong-le*，YU Jian，WANG Fa-xiang，WANG Jian-hui
(Department of Food and Biology Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

In this work, an orthogonal array design was used to optimize process conditions for the enzymatic modification of rice glutelin using glutaminase based on degree of deamidation (DD) and solubility. The optimum experimental conditions for modifying rice glutelin were 1:7, 37 ℃, 7.0 and 24 h for enzyme/substrate ratio, temperature, pH and time, respectively. The DD and solubility of modified rice glutelin under these conditions were 52.76% and 93.78%, respectively.

rice glutelin；glutaminase；deamidation

TS213.3

A

1002-6630(2013)04-0047-04

2011-12-08

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD31B08)；國家自然科學基金青年科學基金項目(31101214；31201427)

李向紅(1979—)，女，副教授，博士，研究方向為農產品深加工與植物蛋白工程。E-mail：xianghongl@163.com

*通信作者：劉永樂(1962—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術與農產品深加工。E-mail：lyle19@163.com