GFP標記Lewis肺癌細胞3LL頸內動脈注射建立腦轉移癌動物模型的可行性研究＊

徐 磊，周 偉，劉 科

（重慶市急救醫療中心神經外科 400014）

肺癌是當今世界上對人類健康和生命威脅最大的惡性疾病之一，肺癌腦轉移（lung cancer brain metastasis）是肺癌患者主要的死亡原因，也是肺癌治療失敗的常見原因之一，肺癌腦轉移的主要途徑是通過血運轉移。血運性腦轉移癌的發病率較高、臨床預后極差，影響因素錯綜復雜。本研究使用穩定轉染表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的Lewis肺癌細胞系3LL通過頸內動脈注射入C57BL／6小鼠腦部，建立血運性腦轉移癌模型，觀察肺癌腦轉移的生物學特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C57BL／6小鼠16只，雌雄各8只，4月齡，雄性體質量（35±1）g，雌性體質量（30±1）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.1.2 細胞株 Lewis lung cancer cell line 3LL細胞購自A-merican Type of Cell Culture （ATCC，Cat.CRL1642），與C57BL／6小鼠有相同遺傳背景。

1.1.3 試劑 pGPU6-GFP-Neo siRNA質粒來自GenePharma。Lippo2000來自Invitrogen。高糖DMEM培養基購自Sigma公司、胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程公司；一抗羊多聚抗中間絲蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）來自Santa Cruz，二抗HRP多聚抗羊來自Sigma-Aldrich。牛血清清蛋白來自鹽城賽寶生物科技有限公司。DAB來自DAKO公司。

1.1.4 特殊手術器械 BD Micro-Fine 31Gx5mm胰島素注射針頭。自制注射器。Hugo Sachs Elektronik微血管夾（Micro Vascular Clips）購自東樂自然基因生命科學公司。

1.1.5 設備 奧林巴斯BX41光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 GFP轉染建立穩定轉染的細胞系 使用Invitrogen公司Lippo2000標準程序將pGPU6-GFP-Neo siRNA vector轉染進Lewis肺癌細胞系3LL，用1 000μg／mL G418篩選1周后，改用500μg／mL濃度維持篩選壓力，生長至6個10cm培養皿細胞滿90%時用流式細胞儀篩選出GFP表達強陽性的10%細胞，如此篩選重復3次，建立100%GFP強陽性的穩定轉染細胞系。為了保證盡可能多的細胞基因型存在，避免單克隆株篩選法篩選到不具備致病力的細胞，不采用挑選單克隆株的辦法。如圖1。

圖1 100%穩定轉染GFP的Lewis肺癌3LL細胞系（×200）

1.2.2 頸內動脈注射Lewis 3LL肺癌細胞建立肺癌腦轉移動物模型及分組 采用的頸內動脈注射法系Schackert和Fidl改良法［1］，C57BL／6小鼠腹腔注射氯胺酮（5mg／kg）／甲苯噻嗪（50mg／kg）的混合物以麻醉，麻醉后放置在解剖顯微鏡下的塑料板上。用橡皮筋放置在門齒之間固定小鼠頭部。頸部備皮、消毒后。做2cm長正中切口，暴露氣管，分離胸鎖乳突肌及肩胛舌骨肌暴露頸動脈鞘，游離頸動脈，近心端和遠心端各放置1枚微血管夾。閉合近心端微血管夾，用BD 31G針頭輕輕挑破頸動脈，插入自制注射器至頸內動脈。將100 000細胞／20μL Lewis 3LL肺癌細胞緩慢注入20μL，再緩慢追加20 μL PBS。穿刺點遠端上微血管夾，取出注射器，10-0強生公司prolene縫線縫合血管穿刺口，取出微血管夾，輕壓頸動脈穿刺點1～3min以止血，縫合皮膚。術畢使用熒光影像系統檢測帶綠色熒光蛋白的3LL細胞注射入腦成功。麻醉復蘇后次日，從存活的15只小鼠中隨機選擇雌雄各6只，用熒光影像系統檢測后隨機按雌雄各分為2組，每組3只：雄性2組編號分別為M1、M2，雌性2組編號分別為F1、F2。

1.2.3 記錄 接種完成后，每天早、晚2次觀察手術部位有無感染，每日稱量小鼠體質量并記錄，繪制曲線，觀察小鼠有無毛發混亂、弓背、行走不穩等癥狀出現，選用全身嚴重衰竭、行走不穩、呼吸短促、體質量下降30%以上作為處死標準。記錄小鼠處死時間。

1.2.4 收集腦組織和病理染色

1.2.4.1 小鼠多聚甲醛灌注固定 小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg／kg）／甲苯噻嗪（5mg／kg）的混合物深度麻醉平穩后，在解剖顯微鏡下剪開胸腔，暴露心臟。吊瓶里裝入預冷PBS，將輸液套筒針刺入左心室（心尖處），打開輸液開關，快速灌注。同時在右心房剪一小口，使血液和灌洗液可以排出。灌入約50 mL生理鹽水后，觀察從右心房流出的液體已經變成無色透明，說明血液已經沖洗干凈。換1個裝有過濾后預冷過的4%多聚甲醛的吊瓶繼續輸液。當多聚甲醛輸入體內時，小鼠會劇烈抽搐。待抽搐停止后，再持續輸注4%多聚甲醛5min（每只小鼠量共約100mL），多聚甲醛即可將小鼠體內各臟器充分固定，牽拉四肢有僵硬感。此時已經固定完畢，可以取出腦組織。

1.2.4.2 病理和免疫組織化學染色鑒定 收集腦組織，更換4%多聚甲醛3次并用70%乙醇溶液漂洗3次后，脫水、固定、包埋、切片、烘干。染色時二甲苯脫蠟后梯度乙醇水化。（1）直接H＆E染色封片；（2）浸泡在枸櫞酸抗原修復液中加熱做抗原修復，PBS漂洗后1%過氧化氫-50%甲醇溶液封閉內源性過氧化物酶，PBS漂洗后5%牛血清清蛋白溶液封閉20min，加1∶500稀釋的一抗羊多聚抗GFAP 4℃孵育過夜，PBS漂洗后加1∶200稀釋的二抗HRP抗羊孵育30min，PBS漂洗后鏡下觀察控制DAB染色時間，及時PBS漂洗，漂洗終止染色，H＆E染色封片。

1.3 統計學處理 采用SPSS12.0統計學軟件進行統計學分析。各實驗均重復3次，計量數據用±s表示，多組間的比較采用單因素χ2分析，組間數據比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體質量觀察 見表1。

表1 頸內動脈注射GFP（＋）3LL細胞后C57BL／6小鼠體質量觀察（g）

續表1 頸內動脈注射GFP（＋）3LL細胞后C57BL／6小鼠體質量觀察（g）

2.2 存活時間 見表2、圖2。

表2 頸內動脈注射GFP（＋）3LL細胞后小鼠生存時間（d）

圖2 頸內動脈注射3LL細胞后小鼠生存時間

2.3 腦組織熒光顯微鏡觀察 見圖3。

圖3 穩定轉染后GFP（＋）的3LL細胞注射3周后鼠腦（×20）

2.4 病理染色 見圖4～5。

圖4 頸內動脈注射3周后腦內多發轉移性腫瘤

圖5 頸內動脈注射4周后腦內融合的轉移性腫瘤

3 討 論

3.1 肺癌腦轉移是最常見的顱內轉移的惡性腫瘤，患者的中位生存時間僅為2～3個月，即使積極手術切除、放療、化療，也僅僅只能延長它的中位生存期至6～8個月［2］。肺癌腦轉移是臨床上肺癌患者病情發展或晚期的表現，是肺癌患者死亡的主要原因，也是治療肺癌失敗的常見原因之一，無論是否手術切除原發病灶，有50%～60%的肺癌患者最終會發生腦轉移［3］。隨著CT、MRI、PET、SPECT等各種影像學檢查手段的不斷進步［4］，肺癌腦轉移的早期檢出率大大提高，手術療效得到判斷［5-6］，患者的預后得到改善，生存時間得到延長。但由于患者往往伴有因腦轉移灶占位以及瘤周腦組織水腫嚴重導致高顱壓所引起的劇烈頭痛、嘔吐、肢體偏癱、語言功能障礙、智力智能減退等神經功能障礙癥狀，生活質量極差。

3.2 肺癌腦轉移的機制目前尚不明確，目前公認的肺癌腦轉移的主要途徑是通過血運。肺癌細胞生長快速、癌細胞之間縫隙連接松散使細胞容易脫落，癌細胞易脫落后移行進入肺組織豐富的血管中，隨血液經肺靜脈進入體循環，隨頸動脈或椎-基底動脈上行到達腦組織后停留、聚集、黏附在終末血管床，增殖、腦血管內皮包裹生長、跨內皮遷移穿透血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）［7］，形成轉移灶。要研究“轉移”，最可行的方法就是體外腫瘤細胞培養加體內實驗——建立腫瘤轉移的實驗動物模型。目前，建立腦轉移癌動物模型的方法主要有4種：（1）腦內局部原位注射；（2）皮下注射；（3）尾靜脈注射；（4）頸內動脈注射。其中腦內原位注射建模成功率高，但一般只有單發腫瘤，且不能模擬腫瘤細胞自血管內生長移行透過血腦屏障的過程；皮下注射一般只產生局部腫塊，僅少數發生遠處轉移，往往需要在實驗動物體內反復傳代才可能有很低的概率誘發腦轉移；尾靜脈注射后發生腦以外的肺部、骨等其他部位轉移的概率高，建立腦轉移癌模型的成功率低。本研究體內實驗中系使用100%穩定轉染GFP的Lewis 3LL肺癌細胞細胞經頸內動脈注射直接入腦建立小鼠腦轉移癌模型的方法。收集的注射3周以后腦組織標本在熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光蛋白的富集區域，證實有穩定轉染GFP的Lewis 3LL肺癌細胞增殖、生長形成腫瘤。免疫組織化學染色見細胞核膜增厚，核大小、形狀、染色不一，核分裂像增多，核仁肥大數目增多，有雙核、多核、巨核及奇異形核，核內染色加深，染色質呈粗顆粒狀，分布不均勻，為惡性腫瘤的病理組織學特征。病灶周圍有激活的反應性星型膠質細胞增生，符合腦內惡性腫瘤的生物學特性——就像一個永不愈合的傷口，起到與創傷性損傷類似的作用，導致反應性星型膠質細胞的增生［8-11］，而與此同時反應性星型膠質細胞又反過來保護腫瘤細胞繼續生長［12-13］。證明這一模型能真實地模擬肺癌血運型轉移的過程和結果。

本實驗中采用的頸內動脈注射法直接模擬癌細胞在腦部的終末毛細血管床內聚集、黏附、侵襲穿透血腦屏障、增殖和在腦血管內皮包裹之下生長、跨內皮遷移穿透BBB形成轉移灶，長出新生微血管的真實過程。頸內動脈注射顯微手術技術簡單、手術技巧要求低，成功率高，本例手術存活率93.75%。使用的Lewis肺癌細胞與C57BL／6小鼠具有相同遺傳背景，建模成功率高，手術成功的小鼠術后100%發生腦轉移癌。未作特殊藥物處理的自然病程的小鼠中位數生存時間僅為24.5d，實驗周期短，節約資金和人力成本。是一種經濟有效的建立腦轉移癌動物模型的方法。

3.3 頸內動脈注射手術技巧。術中鈍性分離胸鎖乳突肌及肩胛舌骨肌以暴露頸動脈鞘，暴露困難時可剪斷肩胛舌骨肌。解剖游離出頸動脈時注意不要過度牽拉或損傷迷走神經以及頸動脈鞘下方的頸交感干。上微血管夾時避開頸動脈分叉處、迷走神經以及頸交感干。手術中小鼠死亡1只，手術死亡率為6.25%。考慮系牽拉迷走神經導致心跳呼吸驟停，注射成功后10-0強生公司prolene縫線縫合血管穿刺口，輕壓頸動脈穿刺點1～3min均即可以可靠止血。

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