表達在HEK293細胞上的BKCa通道基本特性與動力學調控研究＊

譚曉秋，程 俊，程秀麗，李 暢，毛 亮，曾曉榮，曹濟民，楊 艷△

（1.瀘州醫(yī)學院醫(yī)學電生理省部共建教育部重點實驗室，四川瀘州646000；2.中國醫(yī)學科學院／北京協和醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所，北京100005）

大電導鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BKCa）是血管平滑肌重要的鉀離子通道之一，攜帶了70%～80%的外向電流，在調節(jié)血管張力、血流量和血壓活動中起重要作用。了解作為調節(jié)血管張力的靶點及內源性活性物質配體的BKCa通道的特性，對于深入研究通道調控機制及臨床治療藥物篩選等有重要意義［1-4］。BKCa通道受細胞內Ca2＋濃度和膜電位二者的調節(jié)［5］。當肌緊張性增高時，Ca2＋內流激活肌漿網釋放細胞內鈣，再加上膜的去極化共同激活BKCa通道，使K＋外流，膜電位向超極化方向變化而使血管舒張，從而對抗張力增高引起的去極化及收縮作用，使細胞恢復到下一次興奮前的備用狀態(tài)。BKCa通道就是通過環(huán)形負反饋機制來控制平滑肌細胞肌源性張力和靜息膜電位去極化的程度。而BKCa通道的高電導性及在平滑肌細胞上的高密度表達決定了它對血管張力的調節(jié)尤顯重要［6-9］。目前對于BKCa通道的研究更是深入基因和分析水平，而離子通道藥物作用的動力學調控更是研究的熱點之一［4，6］。但是天然細胞由于通道不單一、表達密度不確定等特點，在研究動力學調控方面，異源表達越來越受人們青睞。本研究以HEK293細胞系為載體，構建穩(wěn)定表達人BKCa通道細胞系，研究其基本電生理學特征和建立動力學調控模型，為進一步廣泛深入的研究藥物動力學作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 含有人血管平滑肌BKCa通道α亞單位的表達質粒pcDNA3.1-BKα由丹麥NeuroSearch公司Philip K.Ahring教授饋贈，β1亞單位的表達質粒pIRES-β1由本實驗室構建。改良Eagle高糖培養(yǎng)基（DMEM）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細胞培養(yǎng)及轉染和篩選 HEK293細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）在5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)和傳代。細胞密度80%左右使用脂質體（lipofectamine 2000，Invitrogen）轉染法，將4μg的質粒轉染到3.5mm的培養(yǎng)皿中。使用0.8mg／mL G418進行篩選，得到穩(wěn)定表達pcDNA3.1-BKα和（或）β1的 HEK293細胞系用于進一步實驗。

1.2.2 全細胞膜片鉗實驗 選取電極阻抗3～5mΩ進行。浴液為：NaCl 137.00mmol／L，KCl 5.90mmol／L，MgCl21.20 mmol／L，CaCl21.8mmol／L，葡萄糖 14.00mmol／L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10.00mmol／L（pH 7.4）；電極液：KCl 128.00mmol／L，NaCl 12.00mmol／L，MgCl24.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L，乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）0.05mmol／L（pH 7.2）。鉗制電位為-80mV，刺激方案包括階躍刺激方案：-80mV～＋90mV，時程400ms。

1.2.3 單通道膜片鉗實驗 本實驗采用的單通道膜片鉗記錄方式包括細胞貼附式、內面向外式和外面向外式，浴液和電極液使用對稱性高鉀溶液，電極阻抗12～15mΩ。電極液和浴液根據細胞膜的方式選擇，保持細胞內液：天門冬氨酸鉀（KAsp）100.00mmol／L，KCl 40.00mmol／L，HEPES 10.00／L mmol（pH 7.2），EGTA 1.00mmol／L；細 胞 外 液：K-Asp 40.00mmol／L，KCl 100.00mmol／L，HEPES-K 10.00mmol／L （pH 7.4），EGTA 2.00mmol／L。

1.2.4 內面向外式宏觀電流（macro-insideout）檢測 選擇離子通道表達密度較高的細胞，使用電極阻抗為3～5mΩ，形成內面向外式膜片，使用宏觀電流記錄方案，觀察局部膜片電流，研究其動力學調控。電極液：K-Asp 40.00mmol／L，KCl 100.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L （pH 7.2），EGTA 2.00mmol／L；浴液：K-Asp 100.00mmol／L，KCl 40.00mmol／L，HEPES 10.00mmol／L （pH 7.4），EGTA 1.00mmol／L。

1.3 統計學處理 采用SPSS14.0統計學軟件進行統計學分析，數據采用Clampfit10.1進行處理。計量資料采用±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HEK293細胞上BKCa的基本電生理學特性 轉染在HEK293細胞系的BKCa電流基本電生理學特性，全細胞構型下，轉染BKCa通道α亞單位的HEK293細胞能夠記錄到一較大外向電流，I-V曲線呈現外向整流特性，能夠被BKCa特異性阻斷劑IbTX（200nmol／L）所阻斷（圖1），表明所記錄到的外向電流主要為BKCa所攜帶。在單通道構型下，細胞貼附式和內面向外式均能記錄到電流幅度隨著電壓增加而增大的單通道電流，開放概率呈現明顯的電壓依賴性。在cell-attached和inside-out構型下，BKCa通道具有明顯的電壓依賴性（圖2）；cell-attached和inside-out BKCa單通道斜率電導分別為（212.64±4.86）pS（n＝12）和（216.38±3.55）pS（n＝10），二者之間差異無統計學意義（圖3）；在inside-out構型下（＋40mV膜電位）BKCa通道鈣離子依賴性的典型電流記錄圖，見圖4；BKCa通道IbTX敏感性，在outside-out構型下，BKCa通道能夠被200nmol／L IbTX阻斷（圖5）。在外面向外式膜片構型下，200nmol／L IbTX幾乎完全阻斷該單通道電流，進一步證明該電流為BKCa電流。同時，通過圖3的I-V曲線可以看，I-V曲線通過0點，反轉電位為0mV，這與對稱性高鉀時的平衡電位一致，表明為鉀離子選擇性電流。

圖1 表達在HEK 293細胞系上的BK通道全細胞電流

圖2 BKCa通道電壓依賴性電流圖

圖3 BKCa單通道斜率電導比較電流圖

圖4 BKCa通道鈣離子依賴性的典型電流圖

圖5 BKCa通道被bTX阻斷電流圖

2.2 HEK293細胞上BKCa動力學調控模型研究 本研究采用兩種方式研究BKCa動力學調控模型（圖6），一種為內面向外式單通道膜片鉗，一種為內面向外式宏觀電流（圖6A）。在內面向外式單通道下，共轉染BKCa通道α和（或）β1亞單位發(fā)現，β1的表達一方面增加了通道的開放該概率，另一方面可以明顯增加通道的開放時程（即平均開放時間，見圖6A彩色）。通過增加通道表達密度，使用內面向外式宏觀電流記錄方式研究通道電壓依賴性、Ca2＋敏感性和通道動力學。在內外向外式宏觀電流記錄中可以分析通道從關閉向開放（C→O）和開放向關閉（O→C）之間轉變的動力學特征（圖6B）。從-80mV去極化到＋150mV通道完全開放，通過擬合得到時間常數為Tau＝1.76ms，而當通道由＋150mV超極化到-80mV時，通道關閉。在此過程中產生尾電流，可以反映通道從開放向關閉轉換的過程，通過擬合得到本例的時間常數Tau＝0.27ms。通過在階躍（step）刺激方案得到的內面向外式宏觀電流（圖6C），隨著去極化電壓的增加，電流幅度增加。計算得到不同電壓下的電導值（G），以G／Gmax-Vm作圖，曲線經Boltzmann方程擬合，得到通道的半數最大激活電壓（V1／2），本實驗在細胞內游離鈣濃度（［Ca2＋］free）為 0.01μmol／L 的是 V1／2為（86.0±9.9）mV，見圖6D。

圖6 表達在HEK293細胞系上的BKCa通道動力學特性

3 討 論

3.1 BKCa通道在HEK293細胞中的表達 作為血管平滑肌細胞膜上表達最為豐富的BKCa通道，一直以來是從事血管活動調控研究的熱點和重點。BKCa通道是很多臨床降血壓藥物中的作用靶點之一，包括一些常見的活血化淤中藥也可以通過激活該通道而發(fā)揮調控血壓的作用［10-13］。隨著研究的深入，僅僅利用急性酶分離的細胞從事BKCa通道調控研究是遠遠不夠的，尤其是血管平滑肌細胞培養(yǎng)之后常常發(fā)生表型的改變，BKCa通道的表達和功能也發(fā)生變化。因此，將通道克隆到工具細胞進行研究是常見的研究方法之一。尤其是一些針對BKCa通道功能結構域和位點突變以及動力學研究。本實驗通過構建和篩選穩(wěn)定的單克隆細胞株并通過電生理學和分子生物學的方法進行鑒定。表達在HEK293細胞上BKCa通道電生理學特性與文獻和本研究報道的急性酶分離天然細胞是一致的，主要包括大電導特性［本實驗內面向外式構型下的電導值為（216.38±3.55）pS］、電壓依賴性、Ca2＋敏感性和IbTX敏感性。通過多種技術和手段證明本實驗構建的細胞株能夠很好的用于BKCa通道功能調控研究。

3.2 BKCa通道動力學調控 目前，對于BKCa通道的功能調控研究已比較的深入，但是從文獻報道看不同藥物表現出不同的作用特點，主要表現在動力學的差異［12］。所謂的通道動力學主要是指通道開放和關閉狀態(tài)相互轉變過程中的機制。這是一個非常復雜的過程。膜片鉗技術是研究離子通道動力學調控的最有效的技術，一方面可以通過單通道記錄技術研究某一單個的離子通道的開放和關閉的動力學特點（圖6A），另一方面也可通過全細胞記錄研究整個細胞的離子通道宏觀動力學，二者互為補充。BKCa通道由α和β1亞單位組成，β1亞單位是通道發(fā)揮正常功能的組成部分，研究表明β1亞單位的功能異常與高血壓的發(fā)生存在密切關系［14-15］。本課題前期研究提示，在高血壓患者存在β1亞單位水平的下調［16］。本研究通過共表達α和β1亞單位可以看出，β1亞單位通過增加通道的開放時程而使通道的開放增加。另外，由于很多物質對BKCa通道的作用位點是在細胞內（如Ca2＋），因此單通道記錄上多采用內面向外式膜片鉗。由于傳統全細胞膜片鉗技術胞內換液非常困難而且穩(wěn)定性較差，因而全細胞膜片鉗在研究BKCa通道胞內作用物質動力學機制上表現出一定的不足之處。本實驗通過增加BKCa通道在HEK293細胞上的表達密度，同時實驗過程中增大記錄電極的口徑（本實驗為3～5mΩ，而不是常用的單通道阻抗12～15mΩ），這樣在一個膜片上就有幾十或者上百個離子通道表達，從而記錄到與全細胞類似的電流，稱之為macro-insideout current（圖6C）。在此基礎上，可以很方便地進行細胞內物質作用研究，比如改變不同的鈣離子濃度。該記錄方式還有一個有單通道記錄相同的優(yōu)點就是記錄更加穩(wěn)定，對防震的要求比傳統全細胞低。因此，該記錄方式可以很好的研究通道的開關動力學、電壓依賴性和鈣離子敏感性。但是，該記錄方式適用于一些直接作用于通道內側的物質進行研究，而對于直接細胞外作用或者與細胞膜上的受體結合而間接作用于通道的物質不適宜選用此種方法。

綜上所述，本實驗構建的穩(wěn)定表達BKCa通道的HEK293細胞系及在此基礎上建立的動力學模型可以很好的用于部分BKCa通道功能研究。

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