AcSDKP對硅肺纖維化大鼠膠原含量及NF-κB p65表達的影響＊

閆靜波

（河北省邢臺市人民醫院病理科 054001）

硅肺是一種常見的職業病，其病變以硅結節形成和廣泛的肺纖維化為特征［1］。N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（AcSDKP）是一種生理性造血系統生長抑制因子［2］。AcSDKP對多器官內的多種類型細胞的增殖、細胞外基質代謝和血管形成等方面有重要的調節作用。它能抑制心臟和腎臟間質成纖維細胞及腎小球系膜細胞的增殖，減少膠原的沉積，對高血壓及心肌梗死后心臟和腎臟纖維化有一定的抑制作用［3-5］。核轉錄因子-κB（NF-κB）是2個亞單位p50和p65組成的異源二聚體，NF-κB參與許多前炎癥介質分子轉錄水平的調控，促進細胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥因子、氧化應激相關酶等大量釋放［6］。本研究觀察了AcSDKP對硅肺纖維化大鼠膠原合成和NF-κB p65的影響，借以探索NF-κB p65在硅肺纖維化發病機制中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康成年雄性Wistar大鼠，體質量180g，購于北京維通利華動物公司；AcSDKP購于瑞士Bachem AG公司；標準α石英粉塵（微粒直徑小于5μm）購于中國預防醫學科學院；藥物釋放泵購于美國Alzet公司；VG試劑盒購于福州邁新生物工程公司；羥脯氨酸測試盒購于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠NF-κB p65抗體購于武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 選用非暴露式氣管插管灌注法制作大鼠硅肺模型，并給予AcSDKP治療。60只清潔級健康成年雄性Wistar大鼠分為3組，（1）對照組：每只支氣管內灌注生理鹽水1.0mL，8周后處死；（2）硅肺模型組：每只大鼠支氣管內灌注SiO250mg／mL，8周后處死；（3）治療組：每只大鼠支氣管內灌注SiO250mg／mL，持續給予 AcSDKP 800μg·kg-1·d-1治療，8周后處死。各組大鼠分別于處理后相應時間點處死。取右下葉肺組織4%多聚甲醛固定、脫水后常規石蠟包埋，4μm連續切片，做HE染色、膠原VG染色和NF-κB p65免疫組化，取右中葉肺組織做膠原羥脯氨酸測定，取右上葉肺組織采用蛋白免疫印跡法檢測NF-κB p65蛋白表達。

1.2.2 HE染色 HE染色后觀察各組大鼠肺組織內硅結節的形成與大小。用圖像分析儀系統測定每只大鼠每張切片隨機選擇5個200倍視野下，硅結節切面總面積占該視野總面積的百分比來半定量硅結節的大小。

1.2.3 膠原VG染色 觀察各組大鼠肺組織內膠原纖維的形成及變化特點，進行膠原半定量分析。染色嚴格按照試劑盒操作說明進行。用圖像分析儀系統測定每只大鼠每張切片5個200倍視野下VG陽性染色的積分光密度值（integral optical density，IOD）來半定量肺內膠原的含量。

1.2.4 膠原羥脯氨酸測定 測定組織羥脯氨酸的含量，可換算成膠原蛋白的含量，以反映實驗各組纖維化程度。采用對二甲氨基苯甲醛顯色法檢測肺組織羥脯氨酸含量，實驗步驟嚴格按照羥脯氨酸測試盒說明書進行操作。

1.2.5 NF-κB p65免疫組化染色 一抗為兔抗大鼠 NF-κB p65抗體，工作濃度1∶100，二抗為羊抗兔，采用SABC法DAB顯色。實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行。每張切片隨機選擇5個視野，在高倍光鏡下（×400）用圖像分析儀測定大鼠肺組織陽性細胞的平均百分數。

1.2.6 NF-κB p65蛋白跡印法 提取大鼠肺組織蛋白，參照蛋白標準曲線進行蛋白含量測定，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移把凝膠內的樣品蛋白轉移到硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1h，一抗體（NF-κB抗體），4℃過夜，二抗，室溫1h，加入堿性磷酸酶顯色劑顯色約20min，將NC膜用掃描儀對蛋白表達條帶進行灰度掃描，經自動圖像分析系統進行半定量分析，以對照組的平均光密度值（OD值）為1，其他各組與對照組相比取值。

1.3 統計學處理 用SPSS12.0進行統計分析，各組間采用完全隨機設計的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大體觀察 （1）對照組雙肺粉紅，彈性良好，表面光滑。（2）硅肺模型組雙肺蒼白，表面可見散在灰白色結節，觸之略有砂粒感。（3）治療組雙肺顏色淺紅，彈性尚好，表面的灰白色的結節比硅肺模型組減少。

2.2 HE染色觀察 （1）對照組大鼠雙肺結構清晰，肺泡壁薄，間質無明顯炎細胞浸潤。（2）硅肺模型組大鼠肺組織內可見局灶性間質性炎癥，以巨噬細胞和淋巴細胞滲出浸潤為主。肺泡間隔水腫增寬，肺組織內見纖維細胞性結節，并出現結節的融合。結果表明：大鼠硅肺模型制作成功。（3）治療組肺組織內纖維細胞結節體積及數量均比硅肺模型組減少，巨噬細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤減少。用硅結節切面面積占整個視野面積的百分比半定量分析硅結節的大小，結果顯示：治療組的硅結節面積比硅肺模型降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 膠原VG染色結果 VG染色膠原呈鮮紅色。（1）對照組膠原主要分布于肺泡間隔及血管壁，其他部位膠原少見。（2）硅肺模型組（圖1A）可見膠原纖維呈條紋狀分布于結節內部及其周圍。（3）治療組（圖1B）膠原分布較硅肺模型組減少，膠原變細稀少。圖像分析儀結果顯示：硅肺模型組膠原含量比對照組增高，是對照組的5.29倍，治療組的膠原含量比對照組降低，是對照組的45.58%，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.4 羥脯氨酸測定結果 羥脯氨酸測定結果顯示：硅肺模型組膠原含量比相應對照組增高，是對照組的1.86倍。治療組的膠原含量比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的60.27%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.5 免疫組化檢測NF-κB p65結果 NF-κB p65定位于胞核或胞質，可表達于肺間質細胞、巨噬細胞和中性粒細胞，呈棕色顆粒。（1）對照組陽性細胞較少，主要表達于胞質，胞核未見明顯表達，肺間質細胞少有表達。（2）硅肺模型組（圖2A）陽性細胞較多，陽性顆粒的表達多位于胞核，陽性細胞主要分布硅結節內部及周圍，肺間質細胞和巨噬細胞表達較多。（3）治療組（圖2B）陽性細胞數量比硅肺模型組減少，陽性顆粒的表達部分轉向胞漿，肺間質細胞和巨噬細胞表達減弱。圖像分析儀結果顯示：硅肺模型組NF-κB p65陽性率比對照組升高，是對照組的2.36倍，治療組的NF-κB P65陽性率比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的64.55%，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 AcSDKP對硅肺大鼠硅結節面積及膠原含量表達的影響（±s，n＝10）

表1 AcSDKP對硅肺大鼠硅結節面積及膠原含量表達的影響（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與硅肺模型組比較。

組別 硅結節面積（HE染色）膠原的IOD（VG染色）羥脯氨酸含量（μg／mg）對照組 0 1 039±291 0.821±0.049硅肺模型組 41.19±8.09▽ 5 496±835▽ 1.528±0.116▽治療組 25.18±5.66＃ 2 505±539＃ 0.921±0.100＃

表2 AcSDKP對硅肺大鼠NF-κB p65表達的影響（±s，n＝10）

表2 AcSDKP對硅肺大鼠NF-κB p65表達的影響（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與硅肺模型組比較。

組別 NF-κB陽性率（免疫組化法）NF-κB OD（免疫印跡法）9.00±4.69 1硅肺模型組 21.24±4.92▽ 2.97▽治療組 13.71±3.92＃ 1.43對照組＃

圖1 AcSDKP對硅肺纖維化大鼠肺內膠原纖維形成的影響 （VG染色×200）

圖2 AcSDKP對硅肺纖維化大鼠肺內NF-κB p65表達的影響 （免疫組化×400）

2.6 免疫印跡法檢測NF-κB p65表達結果 硅肺模型組NF-κB p65蛋白表達比對照組升高，是對照組的2.97倍，治療組的NF-κB p65蛋白表達比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的48.15%，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

硅肺是由于長期吸入大量游離二氧化硅（SiO2）粉塵沉積于肺部引起的一種常見職業病，以硅結節的形成和廣泛的肺纖維化為特征。硅結節形成的初始階段是由吞噬硅塵的巨噬細胞聚集組成，繼而成纖維細胞增生，結節內的膠原不斷沉積，使之發生纖維化，形成纖維性硅結節，同時肺內還有不同程度的彌漫性間質纖維化［7］。

AcSDKP是一種生理性造血系統的生長抑制因子，對大鼠腎臟、心臟間質成纖維細胞及人腎小球系膜細胞的增殖與膠原的合成沉積有抑制作用［8］。AcSDKP能夠減輕糖尿病小鼠腎小球硬化程度，改善小鼠腎臟功能［9］。在大鼠心肌梗死心衰模型中，AcSDKP能夠減輕炎癥，拮抗心臟間質纖維化［10］。在兩腎一夾高血壓大鼠和血管緊張素Ⅱ型高血壓大鼠模型中，AcSDKP同樣能減輕心、腎纖維化的程度［11-12］。

在本研究中，通過硅結節面積測定、大染色測膠原OD值及羥脯氨酸測定膠原含量，均發現治療組肺組織硅結節面積及膠原含量比硅肺模型組減少，證明AcSDK能夠抑制大鼠硅肺纖維化。

近年來，NF-κB與器官纖維化之間的關系日益受到人們的關注。NF-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質，是一種重要的核轉錄因子，在各種因子的相互影響和相互作用的復雜網絡中作為轉錄調節核因子而起中心調控作用，參與免疫反應、細胞分化、生長調控、細胞內信號轉導等［13］。通常NF-κB是2個亞單位p50和p65組成的異源二聚體，細胞處于未激活的靜息狀態時，p65亞單位與B抑制蛋白（I-κB）單體結合，覆蓋p50蛋白的核定位信號，以失活狀態存在于細胞質中。當機體受到外界因素刺激時，NF-κB被誘導活化，從胞質轉向胞核，與DNA鏈上特異部位結合，誘導和增強其基因表達，導致促炎細胞因子、氧自由基、一氧化氮及前列腺素等炎性介質大量產生，引發炎癥免疫反應，從而促進器官纖維化［14-15］。

在本研究中，通過免疫組化和免疫印跡法檢測發現硅肺模型組NF-κB p65表達比對照組明顯增高，并且對照組NF-κB p65陽性顆粒主要為胞漿表達，而硅肺模型組中陽性的部位多在胞核，以肺間質細胞和巨噬細胞陽性表達居多。這與Baroni等［16］在硅肺大鼠肺組織中觀察到的NF-κB表達情況基本一致。反映了硅肺大鼠纖維化形成發展過程中NF-κB被激活，由胞質移向胞核，表達增強，促進細胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥因子、氧化應激相關酶大量釋放，他們可引起中性粒細胞及巨噬細胞的活化，增強中性粒細胞及單核細胞趨化功能，刺激成纖維細胞的增殖，導致肺纖維化。在本研究中，治療組肺間質細胞和巨噬細胞的NF-κB p65表達比硅肺模型組降低，并且NF-κB p65的陽性顆粒的表達部分位于胞漿，提示在治療組中，AcSDKP可能會通過增加I-κB的穩定性來抑制NF-κB p65的活性，進而影響著肺泡炎與硅肺纖維化的進展。

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