耐受高體積分數丁醇乳酸菌的篩選及其鑒定

劉洪儒，曹龍奎,,*，孫大慶，宋 亮，楊春宇

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

耐受高體積分數丁醇乳酸菌的篩選及其鑒定

劉洪儒1，曹龍奎1,2,*，孫大慶2，宋 亮1，楊春宇1

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

從不同樣品中分離和篩選在較高丁醇體積分數下生長的菌株，通過不斷提高培養基中的丁醇添加量測定菌株的相對生長率，經過初測和復測，選擇相對生長率較高的菌株繪制其耐受曲線，分析其能夠耐受丁醇的體積分數。對菌株進行常規生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，結合菌體形態及菌落特征確立菌株的種屬。篩選得到2株耐受丁醇的體積分數均達到了3%的菌株，分別為A37和A50。經鑒定，序列分析與生理生化實驗結果是一致的，A37為Enterococcus faecalis，A50為Lactobacillus fermentum。結果表明兩株菌具有較高的丁醇耐受性。

乳酸菌；丁醇耐受性；相對生長率；篩選；鑒定

丁醇除了作為重要的有機化工原料外，還是一種極具潛力的可再生的生物液體燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當，具有低親水性以及不易揮發等特點[1-2]。隨著石油化工生產丁醇成本的增長以及其造成的環境污染問題，使得生物發酵法生產丁醇成為新的研究熱點[3]。進行丁醇發酵的微生物主要是梭狀芽孢桿菌Clostridium acetobutylicum、C.beijerinckii、C.saccharoperbutylacetonicum和C.saccharobutylicum[4-5]。然而，由于丁醇對細胞的毒性，導致在發酵中其產丁醇或者耐受丁醇的體積分數均無法超過20g/L[6-8]。在很大程度上制約了丁醇發酵工業的發展，而且梭菌(Clostridium)從產酸過程到產溶劑過程的過渡中，多復合因子對該細胞代謝過程進行著復雜的調節和控制，不管是通過菌株突變還是通過代謝工程改造的途徑獲得發酵高產的梭菌菌株都是非常困難的[9-11]。因此有必要尋找新的菌株和進行新的發酵丁醇生產途徑的研究。

目前梭菌的丁醇合成及代謝網絡的研究比較清晰[12]，通過構建其他菌株表達系統表達梭菌丁醇合成基因的研究已經獲得成功[13-15]。但由于這些菌株本身對丁醇的耐受性不高并沒有明顯提高丁醇產量，因而尋找耐受高體積分數丁醇微生物是丁醇異源重組生產的關鍵因素。在篩選能夠耐受丁醇微生物的研究中，Knoshaug等[16]通過比較24種微生物對丁醇的耐受性，發現大多數菌株耐丁醇的體積分數在1%～2%之間，幾株酵母菌可以耐丁醇體積分數為2%，只有兩株乳酸菌能耐丁醇體積分數達到3%，說明各種微生物對丁醇的耐受性是不盡相同的。Li等[17]篩選得到能夠在丁醇體積分數為2.5%的培養基中生長的Enterococcus faecium，丁醇體積分數為3%時生長的Lactobacillus plantarum E4，說明乳酸菌可能具有固有的丁醇耐受性。左文樸等[18]得到能夠耐受丁醇體積分數為25g/L的菌株Lactobacillusm ucosae btpz-4-1和Pediococcus pentosaceus btpz-6-3。

本實驗通過自然篩選，從20個樣品中分離能夠耐受高體積分數丁醇的菌株，得到兩株耐受丁醇的體積分數可達到3%的菌株，并對其進行鑒定，確定種屬，為利用這些高耐受菌株構建新的丁醇生產途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

正常人的糞便、果園新鮮及腐爛水果、水果土壤、腌制蔬菜等可能富含乳酸菌的樣本，實驗室4℃保存。

1.2 培養基

MRS液體培養基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏4.0、葡萄糖20.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸二銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·H2O 0.05，吐溫-80 1.0mL，pH 6.2；MRS固體培養基：液體培養基中加入15g瓊脂；篩選培養基Ⅰ：在MRS液體培養基中添加體積分數3%的正丁醇；篩選培養基Ⅱ：在MRS固體培養基中添加3%正丁醇。

1.3 試劑與儀器

正丁醇(分析純) 天津市大茂化學試劑廠；細菌DNA提取試劑盒K713、PCR反應試劑盒 上海英濰捷基生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶 日本TaKaRa公司。

PTC-200型PCR儀 東勝創新生物科技有限公司；電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；UVP-8000凝膠成像系統 美國Ultra-Violet公司；Thermo酶標儀 美國熱電公司；BH-2光學顯微鏡 日本Olympus公司。

1.4 篩選方法

1.4.1 分離及純化

將采集的各種樣品用生理鹽水打散后，取上清液2%接入篩選培養基Ⅰ中，于37℃恒溫靜置培養24h。將能夠生長的樣品管中的菌液進行梯度稀釋在MRS固體培養基和篩選培養基Ⅱ上涂布，37℃恒溫倒置培養48h，獲得單菌落。采用平板劃線法純化，并將純化的菌株接種到MRS液體培養基中培養12h后加適量甘油保藏。

1.4.2 耐受丁醇菌株的篩選

菌株2%接種量37℃活化培養24h，確定此時菌液的OD600nm值。2%轉接含有體積分數為1%丁醇的液體培養基中，37℃培養24h，取200μL菌液加入96孔板中用酶標儀測得OD600nm值，計算其相對生長率，選取相對生長率較高的菌株進行下一步實驗，同樣步驟測定在含有體積分數為2%和3%丁醇的液體培養基中的相對生長率。不接種的培養基作為空白對照，所有實驗重復3次。相對生長率[18]為在含有丁醇的培養基中的OD600nm值與不加丁醇的培養基中的OD600nm值的比值。

1.4.3 菌株耐受丁醇曲線測定

為了防止丁醇揮發，在帶橡皮膠塞的三角瓶中進行菌株耐受丁醇培養和耐受曲線測定。在MRS液體培養基中添加不同體積分數的丁醇，分別為0、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.25%、3.5%，取過夜培養的菌液以2%的接種量接至含有各個不同體積分數丁醇的培養基中，37℃靜置培養，通過測定OD600nm值來檢測菌株的生長情況。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態學觀察

將篩選得到的耐受丁醇體積分數較高的菌株分別接種于MRS固體培養基上，37℃培養24h，觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色，莢膜染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.5.2 菌株的生理生化鑒定

根據常規生理生化鑒定，參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分離鑒定及實驗方法》[19]，對菌株進行生理生化實驗。

1.5.3 菌株16S rDNA序列的測定與分析

1.5.3.1 基因組DNA的提取

經傳代培養15h的菌液用K713細菌試劑盒提取DNA，用化學裂解法[20]提取菌株的基因組DNA。

1.5.3.2 16S rDNA的擴增

采用細菌通用引物27F和1492R擴增16S rRNA基因。引物序列為27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

反應體系：取DNA模板1μL，5×PCR緩沖液10μL，引物1μL，dNTPs 4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，加超純水補至總反應體積為50μL。循環參數：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環；72℃延伸2min。取擴增產物5μL 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀測結果。

1.5.3.3 16S rDNA序列測定及同源性分析

16S rDNA測序由上海英俊生物工程技術服務有限公司完成，將測定的16S rDNA序列在NCBI核酸數據庫進行BLAST搜索，與已有的16S rDNA序列進行相似性比較分析。從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，應用MEGA4.1和ClustalX軟件，采用 Neighbor-Joining方法構建系統發育樹，并進行 Bootstrap分析，重復次數為1000次。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化結果

采集的樣品中只有處理后的正常人的糞便能在篩選培養基Ⅱ中生長，獲得了461個能在丁醇體積分數為3%的培養基中生長的單菌落，初步認為其具有丁醇耐受性，具體結果見表1。

表1 在篩選培養基Ⅱ中分離純化得到的菌株數及其編號Table1 Strains purified in the screening medium and corresponding number

2.2 耐受丁醇菌株篩選結果

將得到的461個單菌落進行復篩，得到22株在含有丁醇體積分數為1%的液體培養基中的相對生長率大于60%，在丁醇體積分數為2%的培養基中相對生長率大于30%的菌株。22株菌的具體數據結果見表2。在菌株篩選的過程中，22株菌在含有丁醇體積分數為1%、2%的培養基中相對生長率均較高，基本處于同一水平，并且實驗重復性良好；當丁醇體積分數繼續提高到3%時，只有A37和A50能夠較好生長且相對生長率達到10%以上，比其他的菌株相對生長率都要高。對比Li等[17]研究中報道的耐受3%丁醇菌株的相對生長率，故選擇A37和A50作為耐受丁醇菌株繼續研究。

2.3 耐受丁醇菌株在含不同體積分數丁醇培養基中的生長曲線

在37℃條件下，菌株A37和A50在12h內的丁醇耐受情況如圖1所示。可以看出，當丁醇體積分數為2%以下時，菌株都能夠非常良好的生長，當丁醇體積分數達到3%時，菌株的生長受到一定程度的抑制，但是依然能夠有一定的生長，當丁醇體積分數達到3%以上時，A37菌株的生長基本受到明顯的抑制。A50在丁醇體積分數為3.25%時還有一定的生長，但在3.5%是基本陷于停滯，這表明，菌株A37和A50都能夠耐受3%的丁醇。

圖1 37℃、培養基中添加不同體積分數丁醇時對A37(A)和A50(B)菌株的生長曲線Fig.1Growth curves of the isolated tolerant strains A37 (A) and A50 (B) in medium containing butanol with various concentrations at 37 ℃

2.4 耐受丁醇菌株的鑒定

2.4.1 菌株A37和A50的菌落和形態特征觀察

菌株A37在MRS培養基上生長成卵圓形，凸起、表面光滑、全緣、乳白色，直徑約為0.5～1.0mm； A50在MRS培養基平板上菌落呈圓形或不規則，扁平、表面光滑、透明，直徑約為0.5～1.0mm。經革蘭氏染色后用顯微鏡油鏡觀察，見圖2，A37菌體形態為球狀，單獨、成對或短鏈排列，革蘭氏染色呈陽性，無莢膜，無芽孢，不形成孢子。A50菌體為短桿狀，單個排列，有時成對或成鏈，形態微小，革蘭氏染色呈陽性，無芽孢。初步判定兩株菌為乳酸菌，A37為球菌，A50為桿菌。

表2 菌株在含不同丁醇體積分數的培養基中的相對生長率(x±s, n=3)Table2 Relative growth rates of the strains in medium containing butanol at various concentrations(x±s, n=3)

表3 菌株A37和A50的生理生化特征Table3 Physiological-biochemical properties of the strain A37 and A50

表4 菌株A37和A50的糖發酵實驗結果Table4 Sugar fermentation results of strains A37 and A50

圖2 菌株A37(a)和A50(b)的顯微鏡照片(10×100)Fig.2 The images of A37 (a) and A50 (b) strain examined by microscope (10×100)

2.4.2 菌株A37和A50的生理生化及糖發酵實驗

根據鏡檢結果先確定其在乳酸菌中屬的地位，結果見表3，然后再根據屬內種間的主要特征進行鑒定，結果見表4。通過各種生理生化實驗，再結合各菌株的形態結構和培養特性分析，將A37鑒定為糞腸球菌，A50為發酵乳桿菌。

2.4.3 菌株16S rDNA鑒定及進化樹分析

圖3 菌株的16S rDNA PCR擴增產物Fig.3 PCR amplified products of 16S rDNA gene from the strains

由圖3可知，測序結果表明擴增菌株的16S rDNA序列全長A37為1446bp，A50為1462bp。在1500bp左右處出現亮帶，無其他雜帶。

BLAST與GenBank中的核酸數據進行比對分析，結果A37與糞腸球菌屬Enterococcus faecalis(AB154827)的序列相似性為99%。A50與發酵乳桿菌屬Lactobacillus fermentum (JF812168)的序列相似性為99%。將序列提交GenBank數據庫，得到登錄號分別為JF903802和JF903803，根據1.5.3.3節的方法進行鑒定，建立系統進化樹(圖4)，結果表明，菌株A37與Enterococcus faecalis聚在同一分支，1000次 Bootstrap分析完全支持該分支，同源性達100%，與其他種的發育關系相對較遠。菌株A50在系統發育地位上Lactobacillus fermentum在同一分支，與其相鄰菌株親緣關系較遠。結合菌落特征和生理生化鑒定結果將菌株A37鑒定為糞腸球菌，A50鑒定為發酵乳桿菌。

圖4 菌株A37(A)和A50(B) 的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.4 Phylogenentic tree of strain A37 (A) and A50 (B) based on the 16S rDNA gene sequences

3 討 論

采用有一定生長壓力的平板法從采集樣品中分離，限制了很多細菌的生長，減輕篩選的工作量。同時結合Li等[17]建立的以測定菌株的相對生長率為指標對其進行篩選，利用酶標儀96孔板檢測菌株的OD600nm值，提高了篩選的效率，得到較理想的目的菌株，而且本研究中得到的耐受3%丁醇的菌株比左文樸等[18]篩選得到的菌株的耐受體積分數高，基本達到研究中報道的耐受水平，但已報道的可以耐受3%丁醇的菌種中未見發酵乳桿菌。

菌株A37和A50鑒定為糞腸球菌和發酵乳桿菌，屬于乳酸菌類，拓展了乳酸菌的應用范圍。在進行菌種分類鑒定時，僅僅根據表型特征來劃分是不可取的。在進行常規鑒定時，有時會出現表型不夠穩定、或弱反應等現象，這些都直接影響了實驗結果的判斷，而且很多表型特征不同的菌株通過16S rDNA基因序列比對后，結果卻為同一種。所以，要具體鑒定某一未知菌種，在依據表型特征鑒定的同時，要結合基因型鑒定，才能夠比較準確的進行分類鑒定。

篩選得到的耐受丁醇的菌株為構建其他耐受丁醇基因工程菌株生產丁醇提供了新的菌種資源，具有良好的工業應用價值。研究表明丁醇產量具有很大的提升空間，但對摸清其遺傳背景，通過分子生物學技術改造使其生產丁醇仍需進一步研究。

[1] SCHWAR W H, DOMINIK A. Biofuels from microbes[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 77: 23-35.

[2] ZVERLOV V, BEREZINA O, VELIKODVORSKAYA G, et al. Bacterial acetone and butanol production by industrial fermentation in the Soviet Union: use of hydrolyzed agricultural waste for biorefinery[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 71(5): 587-597.

[3] 姜岷, 韋萍, 盧定強, 等. 后化石經濟時代工業生物技術發展的若干思考[J]. 化工進展, 2006, 25(10): 1119-1123.

[4] KEIS S, SHAHEEN R, JONES D T. Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp.nov. and Clostridium saccharobutylicum sp.nov.[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 51(Pt6): 2095-2103.

[5] PAPOUTSAKIS E T. Engineering solventogenic clostridia[J]. Curr Opin Biotechnol, 2008, 19: 420-429.

[6] NASIB Q, BADAL S, MICHAEL C. Butanol production from wheat straw hydrolysate using Clostridium beijerinckii[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2007, 30(6): 419-427.

[7] BORDEN J R, PAPOUTSAKIS E T. Dynamics of genomiclibrary enrichment and identification of solvent tolerance genes for Clostridium acetobutylicum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(9): 3061-3068.

[8] EZEJI T, QURESHI N, BLASCHEK H P. Butanol production from agricultural residues: impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation[J]. Biotechnol Bioengineering, 2007, 97: 1460-1469.

[9] SCOTCHER M C, RUDOLPH F B, BENNETT G N. Expression of abrB310 and sinR, and effects of decreased abrB310 expression on the transition from acidogenesis to solventogenesis, in Clostridium acetobutylicum ATCC 824[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(4): 1987-1995.

[10] THORMANN K, FEUSTEL L, LORENZ K, et al. Control of butanol formation in Clostridium acetobutylicum by transcriptional activation[J]. Journal of Bacteriology, 2002, 184(7): 1966-1973.

[11] DURRE P. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 49(6): 639-648.

[12] 楊明, 劉力強, 牛昆, 等. 丙酮丁醇發酵菌的分子遺傳改造[J]. 中國生物工程雜志, 2009, 29(10): 109-114.

[13] ATSUMI S, CANN A F, CONNOR M R, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production[J]. Metabolic Engineering, 2008, 10(6): 305-311.

[14] INUI M, SUDA M, KIMURA S, et al. Expression of Clostridium acetobutylicum butanol synthetic genes in Escherichia coli[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 77(6): 1305-1316.

[15] STEEN E J, CHAN R, PRASAD N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol[J]. Microbial Cell Factories, 2008, 7: 36.

[16] KNOSHAUG E, ZHANG Min. Butanol tolerance in a selection of microorganisms[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 153(1): 13-20.

[17] LI J, ZHAO J B, ZHAO M, et al. Screening and characterization of butanol-tolerant micro-organisms[J]. The Society for Applied Microbiology, 2010, 50: 373-379.

[18] 左文樸, 裴建新. 兩株高丁醇耐受細菌的分離鑒定及其丁醇耐受特性的研究[J]. 生物技術通報, 2009(12): 155-159.

[19] 凌代文, 東秀珠. 乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1999.

[20] AUSUBEL F M, KINGSTON R E. 精編分子生物學實驗指南[D]. 北京: 科學技術出版社, 2001: 36-39.

Screening and Identification of Butanol-Tolerant Lactic Acid Bacteria

LIU Hong-ru1，CAO Long-kui1,2,*，SUN Da-qing2，SONG Liang1，YANG Chun-yu1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；2. Agri-food Processing and Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing 163319, China)

Bacterial strains that can grow well in the presence of butanol at high concentration were isolated and screened from different samples. Their relative growth rates in the medium with the addition of butanol were monitored. Subjected to repeated screening, the strains with higher relative growth rates were chosen to make the butanol-resistant curve. Meanwhile, the species of the selected strains were identified by physiological and biochemical experiments and 16S rDNA analysis coupled with bacterial colony characteristics. Two bacterial strains (A37 and A50) revealed the butanol tolerance up to 3%. The 16S rDNA sequence analysis exhibited the consistent results with biochemical analysis. Moreover, A37 and A50 were identified as Enterococcus faecalis and Lactobacillus fermentum.

lactic acid bacteria；butanol tolerance；relative growth rate；screening；identification

Q939.97

A

1002-6630(2013)03-0212-05

2011-10-18

黑龍江省研究生創新科研項目(YJSCX2011-265HLJ)

劉洪儒(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：liuhongru886@126.com

*通信作者：曹龍奎(1965—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：longkuicao@yahoo.com.cn