乙醇非氧化代謝產物脂肪酸乙酯的研究進展

李江濤，張久亮，何 慧*，聶志奎，馬芝麗

(華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

乙醇非氧化代謝產物脂肪酸乙酯的研究進展

李江濤，張久亮，何 慧*，聶志奎，馬芝麗

(華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，FAEEs)是乙醇經非氧化代謝途徑的產物，其在誘導器官損害方面發揮著重要的作用，可作為長期攝入酒精的標記物。本文對FAEEs在體內的毒性、作為酒精攝入標記物的證據、相關合成酶提取以及FAEEs的檢測等方面的研究進展進行綜述，以期為乙醇代謝研究方面提供一定的理論依據。

脂肪酸乙酯(FAEEs)；乙醇非氧化代謝；乙醇攝入標記物；細胞毒性

2011年以來，我國白酒消費人群大約有4億，年實際消費量在500萬t左右。過量攝入酒精對人體消化、神經、骨骼、造血等多種系統都有一定毒性。乙醇的代謝途徑主要是氧化代謝，即在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒體乙醇氧化系統和過氧化氫酶的作用下氧化為乙醛，乙醛進一步在乙醛脫氫酶的作用下氧化為乙酸。同時，乙醇還可通過非氧化方式與脂肪酸發生酯化反應，生成脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，FAEEs)，這個代謝過程是通過脂肪酸乙酯合成酶催化完成的[1]，當乙醇有氧代謝被抑制時，將會增加FAEEs的生成量，FAEEs的存在很可能導致胰腺炎、肝炎、心肌消融等疾病危害。

長期嗜酒對人體的傷害是很嚴重的，雖有研究[2]表明，酒精攝入量與肝損害的嚴重程度并不呈顯著相關，但據有關調查發現，嗜酒人群中約有20%～30%會出現嚴重的肝損害[3]。另有相關器官驗尸結果證明，人體器官的損傷很多時候是因為酒精濫用造成的[4]。在急性酒精中毒的案例中，FAEEs在人體胰腺中含量最高，此外，肝臟、心臟和大腦等器官中也有較低濃度的FAEEs存在；并且在胰腺中并未發現乙醇有氧代謝的產物——乙醛[5]。這表明，在酒精中毒案例中，人體內的FAEEs含量可作為一個關鍵的衡量指標。通過體內實驗發現，在胰腺和肝臟中，通過抑制可在有氧條件下催化乙醇氧化為乙醛的酶(ADH、細胞色素P450和過氧化氫酶等)的活性即可抑制酒精的氧化代謝，從而使乙醇按生成FAEEs的非氧化代謝途徑進行反應[6]。

1 脂肪酸乙酯的毒性

早在1963年，Goodman和Deykin就對脂肪酸乙酯進行了相關描述，認為它是乙醇的代謝產物，Goodman在1980年進一步提出它可能是過量飲用酒精導致器官損傷的媒介物；特別在乙醇氧化功能缺陷或者較弱的組織中，可以導致組織細胞膜結構和功能的異常、細胞膜氧化磷酸化的脫偶聯及蛋白質的合成受抑制等[7]。到1986年，對急性酒精中毒致死的人進行解剖實驗發現，酒精濫用和FAEEs的產生有重要聯系。驗尸結果表明，FAEEs的產生和器官損傷有很強的相關性，可作為酒精攝入的標記物[5]。酒精濫用致器官的損害大部分發生在胰腺、肝臟、心臟和大腦。據檢測，這些器官中通常含有很高活性的脂肪酸乙酯合成酶和高濃度的FAEEs。近年來，有研究[8]表明乙醇攝入后產生FAEEs，然后傳送到心臟，進而引起心肌消融。因此，心肌消融的機制可能涉及到FAEEs的細胞毒性作用。

目前，眾多的體內和體外實驗均證實FAEEs在體內和體外均顯示出毒性作用。Zbigniew等[9]通過體外實驗研究發現FAEEs融合于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)中，能夠發揮其完整的細胞毒性作用。利用600μmol/L的油酸乙酯或800μmol/L的花生四烯酸乙酯培養人肝癌HepG2細胞，其對細胞生長的抑制率分別達到31%和37%，LDL與400μmol/L的油酸乙酯培養HepG2細胞，會使其蛋白質合成率下降41%。同時，透射電鏡觀察結果顯示，細胞形態也會發生了很大變化，尤其是細胞核內的染色質固縮。該研究還證實了FAEEs在LDL內能夠降低HepG2細胞的復制及蛋白酶的合成速率[10]。人們在培養細胞時發現，FAEEs的合成在人肝癌HepG2和E47細胞(即轉染并表達人CYP2E1的HepG2細胞)中比在人肺細胞VA13和VL-17A細胞(即過表達乙醇脫氫酶和CYP2E1的人肝癌HepG2細胞)中濃度增長幅度更高[11]。該研究表明，一方面，不管CYP2E1(細胞色素P4502E1)是否過表達，ADH催化乙醇氧化是其主要的機制；另一方面，不管CYP2E1是否過表達，在E47細胞中，發現乙醇無氧代謝產物FAEEs能夠降低ADH的活性。因此，CYP2E1介導的乙醇氧化可能是次要的機制。Hikmet等[12]研究表明，FAEEs能夠誘導HepG2細胞發生凋亡，并且干擾了細胞的G2/M期，使細胞的S期下降[13]。

Walter等[14]通過體內實驗發現，在大鼠內，通過灌胃濃度為11μmol/L的FAEEs為核心的低密度脂蛋白，大鼠全身會發生水腫，細胞內脂質堆積，導致胰腺細胞膜受損，這可能是血清蛋白酶和胰腺酶原被激活的緣故。目前，雖已有不少專家、學者認同FAEEs在乙醇濫用中作為媒介物引起器官的損傷這一觀點，但是其導致細胞毒性的機制尚待進一步研究。有研究[15]提出這可能是水解的FAEEs抑制了細胞核的轉錄，但尚無可靠的理論依據。

2 脂肪酸乙酯代謝相關酶及其代謝途徑

目前，在體內催化FAEEs合成的酶有脂蛋白脂肪酶、羧酸酯酶、羧基酯脂肪酶等，FAEEs的催化合成，可能需要2種酶，即水解酶和酯合酶，并且水解酶是限速酶。細胞質中的酶，例如谷草轉氨酶、脂肪酶、淀粉酶會在肝臟和胰腺受損后出現在血液中，可以假設FAEEs合成酶既與細胞質、細胞膜結合，同時也會在肝臟和胰腺損傷后釋放到血液中[8,16]。

在1984年，從兔心肌介質中分離純化出FAEEs酯合酶，在分離純化前，通過DEAE-纖維層析柱分離得到2種活性峰，純化后兩者的含量在總提取物中的比例超過了40%，SDS-PAGE分析得到單一的多肽，其分子質量為26kD，采用凝膠滲透色譜分析表明，活性酶的分子質量為50kD, 這一結果表明，這種酶是由2個相同或接近相同的亞基組成的可溶性二聚體酶[17-18]。

1987年，研究發現人的大腦灰質合成酶活性大約是腦白質合成酶活性的2倍。通過離子交換色譜分離得知，這兩種形式的合成酶存在于灰質和白質組織勻漿后的細胞質或松散結合的膜組分中[19]。這份報告同時表明，血液中乙醇濃度較高，在大腦皮層中FAEEs濃度亦較高，這表明，FAEEs在人類大腦中能致急性中毒。

1991年，有研究者測定了攝入乙醇的大鼠脂肪組織中的不同時期的FAEEs的濃度和FAEEs合酶活性，在乙醇灌胃10周后，每克脂肪組織檢測到300nmol FAEEs，更重要的發現是，FAEEs從乙醇停用1周后完全消失[19]。在這項研究中發現大部分FAEEs存在于一個孤立的脂肪組織中，而不是在細胞質中。而且乙醇攝入停止后，酶的活性下降了很多，說明FAEEs合成酶的活性受到是否存在乙醇外源性介質的影響[19]。

Tony等[20]研究表明，FAEEs合成酶以細胞質和微粒的形式存在，并產生其他的活性。細胞質FAEEs合成酶的活性體現在使用乙醇和游離脂肪酸作為底物，合成FAEEs，被稱為FAEEs合成酶；微粒FAEEs合成酶的活性體現在使用乙醇和脂肪酰基輔酶A為底物，被稱為酰基輔酶A:乙醇酰基轉移酶(AEAT)。

3 脂肪酸乙酯作為乙醇攝入的標記物

很早以前，人們就知道血液中乙醇可以作為乙醇攝入的標記物，但是血液中乙醇在體內會很快被降解，因此，需要一個指標可以用來作為乙醇攝入的長期標記物，在玻璃化溫度條件下的乙醇濃度可能作為乙醇攝入的長期標記物，但是這也只是一種假設[21]。乙醇攝入后血液中的FAEEs濃度保持時間長達24h，FAEEs在血液中消失的衰減曲線與血液中乙醇的衰減曲線相似[22-23]。而FAEEs的消除是個非常緩慢的二級反應，所以在酒精攝入24h后，FAEEs仍存在于血液中，這些數據使人們得出結論：血液、頭發中的FAEEs能夠被用作酒精攝入的長期標記物[24]。

FAEEs一般被運送到血液中脂蛋白和白蛋白的核心。在脂蛋白核心的FAEEs迅速轉變成磷脂雙層[19]；當血液中FAEEs濃度較低時，其主要存在于白蛋白中，白蛋白攜帶FAEEs的能力很強；隨著血液中FAEEs濃度進一步增加，脂蛋白攜帶的FAEEs濃度亦會增大。

人們了解到，白蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和高密度脂蛋白(HDL)均可以刺激FAEEs，使之從細胞中釋放入血液，并且當細胞暴露在乙醇環境中時，乙醇可誘導FAEEs的合成。攝入相同量的酒精濃度，在女性體內乙醇濃度要低于男性，FAEEs峰濃度顯示，同等體質量的男性與女性相比，前者體內FAEEs濃度比后者高兩倍多[24]。進一步的研究顯示，慢性酒精中毒患者體內比急性酒精中毒患者體內的油酸乙酯含量高。因此，有研究者[25]嘗試證明是否可以用體內油酸乙酯含量的高低來區分慢性酒精中毒和急性酒精中毒。這個實驗結果顯示，慢性酒精中毒患者和急性酒精中毒患者的體內油酸乙酯濃度有顯著差異，前者體內的油酸乙酯濃度顯著高于后者；油酸乙酯濃度的峰值出現的時間與乙醇的濃度峰值出現的時間相近。

由于乙醇在體內代謝快，故在車禍事故發生后通過乙醇濃度來評價是否有酒精攝入并不可靠[26]。所以人們開始嘗試檢測器官組織中FAEEs的濃度，以FAEEs作為酒精攝入的標志物。實驗中，給大鼠的腹膜間注射乙醇，然后讓其存活直至死亡，獲取腹膜間脂肪和肝組織，發現肝臟和脂肪組織中均含有FAEEs[27]。人體心臟肌肉內的FAEEs的正常濃度低于0.001μmol/L，但是在尸檢過程中卻發現，不管是慢性酒精中毒患者還是急性酒精中毒患者，其心臟肌肉內的FAEEs濃度都達到了115μmol/L[26]。Bhupendra等[28-29]等測定了39位病人血液樣本中FAEEs的濃度，并且考察了FAEEs濃度與體內酒精濃度的關系，其中41～50歲年齡范圍的病人FAEEs濃度最高，但性別差異不明顯。在大多數患者中檢測到的主要FAEEs為棕櫚酸乙酯和油酸乙酯，并且FAEEs的濃度隨著血醇濃度的增加而增加，但是相比較而言, 急性酒精中毒患者比慢性酒精中毒患者的FAEEs濃度低(分別為4250、15086ng/mL)。沒有任何慢性酒精攝入患者檢測不出FAEEs，因此，FAEEs是一個可以作為慢性酗酒者體內乙醇攝入更加可靠的標志物。

4 FAEEs的分析測定

如果將血液中FAEEs作為乙醇攝入的標記物，則樣品中FAEEs的穩定性是一個非常重要的問題。對人體血液中FAEEs進行分析，研究收集容器、貯藏時間和貯藏溫度這些因素對血液中FAEEs濃度的影響[5]，結果顯示，室溫條件下4h內需要分離出細胞血漿和血清，然后4h后需要將細胞血漿和血清進行冷凍保存，以方便后續的分析檢測。還發現在裝有EDTA溶液的真空管中FAEEs的含量極少，以至于不能用于分析，這是因為有一個未知的機制降低了FAEEs的濃度。

人在攝入大量酒精后，FAEEs在人體循環中含量大多在50nmol/L～3μmol/L之間，測定低濃度的FAEEs需要靈敏度高和特異性強的檢測方法，例如氣質聯用(GC-MS)。目前GC-MS采用與FAEEs極性相反的聚乙二醇和ZB-WAX毛細管柱來測定FAEEs，整個過程需要30～40min。Clark等[30]利用丙酮沉淀、正己烷提取，氨基丙基硅膠固相萃取法從血清中分離出FAEEs。Politi等[27]利用非極性的二甲基聚硅氧烷柱進行GC-MS分析，對人血漿中FAEEs的峰具有很好的分離度，而且檢測時間縮短了60%以上，檢測下限降到5～10nmol/L，定量下限為60nmol。測量總FAEEs的批內精密度(RSD)低于7%。Kwak等[31]用反相HPLC- MS-MS法檢測人類胎糞中的FAEEs含量，在正離子模式下通過ESI-MS-MS和多反應監測(MRM)進行分離和定量，測定0.33nmol/g的亞油酸乙酯時，FAEEs的絕對回收率為(55±10)%，而當測定1.55nmol/g十四烷酸乙酯時，FAEEs的絕對回收率提高到了(86±8)%。檢測限和定量限的范圍分別是0.01～0.08nmol/g和0.02～0.27nmol/g[32]。

5 結 語

乙醇非氧化代謝產物FAEEs不僅可以作為長期攝入酒精的標記物，還可能作為判斷急性酗酒和非急性酗酒的重要指標，其在人體器官中以在胰腺中含量最高，此外在肝臟、心臟和大腦等器官中亦有較低濃度的FAEEs存在，并且對于胰腺炎的癥狀產生和復發有很大的促進作用。酗酒可產生過多的FAEEs，雖然人們對其毒害作用的認識在不斷深化，但對于FAEEs的細胞毒性和由此造成的器官損傷作用機制并不十分清楚，需要做進一步更深入的研究。在一些生物標記物中，因為FAEEs的高靈敏度和特異性，對頭發中FAEEs的測定，并以此來估計人體內的酒精攝入量，已成為了目前最常用的方法，然而，對于FAEEs的測定大多都采用GC、MS等大型儀器，并且樣品的制備過程較為繁瑣[27]，因此，對于能夠尋找一種簡便、快速、靈敏的檢測FAEEs濃度的方法亦是今后的研究熱點。

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Research Advance in Non-Oxidized Metabolic Products of Ethanol: Fatty Acid Ethyl Esters

LI Jiang-tao，ZHANG Jiu-liang，HE Hui*，NIE Zhi-kui，MA Zhi-li
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Fatty acid ethyl esters (FAEEs), as the non-oxidized metabolic products of ethanol, play an important role in ethanol-induced organ damage and can serve as the long-term markers of ethanol intake. The toxicity of FAEEs in vivo, the extraction of enzymes associated with FAEEs and the detection of FAEEs are summarized in this paper. In addition, the evidence of FAEEs as alcohol intake markers is provided as well.

fatty acid ethyl esters；non-oxidized metabolic product；markers of ethanol intake；cytotoxicity

Q591.9

A

1002-6630(2013)03-0290-04

2011-12-09

國家自然科學基金項目(30972043)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z314)

李江濤(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學和天然產物化學。E-mail：ljthyd@yahoo.com.cn

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學和天然產物化學。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn