鮮食玉米脂氧合酶的酶學性質

劉夫國，金邦荃*，牛麗影，劉春泉，宋江峰，李大婧

(1. 南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2. 江蘇省農業科學院農產品加工所，江蘇 南京 210014；3. 國家農業科技華東(江蘇)創新中心-農產品加工工程技術研究中心，江蘇 南京 210014)

鮮食玉米脂氧合酶的酶學性質

劉夫國1,2,3，金邦荃1,*，牛麗影2,3，劉春泉2,3，宋江峰2,3，李大婧2,3

(1. 南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2. 江蘇省農業科學院農產品加工所，江蘇 南京 210014；3. 國家農業科技華東(江蘇)創新中心-農產品加工工程技術研究中心，江蘇 南京 210014)

本實驗研究鮮食玉米脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)的酶學性質。以新鮮甜玉米、糯玉米籽粒及其胚為試材，采用紫外分光光度法，以亞油酸為底物，探討了酶提取部位、酶促反應溫度、pH值及底物濃度對LOX活性的影響。結果表明，鮮食玉米胚中LOX活性顯著高于鮮食玉米籽粒，其最適反應溫度為55℃，最適反應pH值為6.0，最適底物濃度為8.0mmol/L，提高溫度和延長處理時間能有效地鈍化LOX。

鮮食玉米；脂氧合酶；活性；酶學性質

近年來，鮮食甜玉米和糯玉米因其豐富的營養及鮮、脆、嫩等良好的感官品質越來越受消費者青睞。鮮食玉米采收后，其感官品質常常發生劣變，研究發現，LOX對鮮食玉米貯藏過程中不良風味的形成具有不可忽視的作用[1-2]。LOX廣泛存在于動植物及微生物中，專一催化含有cis,cis-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其相應酯的加氧反應，生成具有共軛雙鍵的多元不飽和酸的氫過氧化物[3]。在果蔬中，該氧化產物可繼續降解為醛類、酮類、醇類、呋喃類等揮發性化合物從而引起果蔬品質劣變。因此，常將LOX作為果蔬加工中貯藏穩定性的重要指標之一。

為了發揮酶催化反應的高效率，全面了解酶作用機制，諸多學者對豆類、水稻、大麥、花生、黃瓜、番茄、蘋果和桃等植物中LOX進行了酶學性質的研究。LOX活性受來源、反應體系pH值及溫度、底物濃度等諸多因素的影響[4]。本研究擬對鮮食玉米LOX的酶學性質作初步探討，以期為鮮食玉米貯藏加工過程中酶活控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食甜玉米(品種為“晶甜3號”)、糯玉米(品種為“京甜紫花糯2號”)，由江蘇省農業科學院提供；亞油酸 美國Sigma公司；氫氧化鈉、吐溫-20、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸、硼砂均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；恒溫水浴鍋 江蘇金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 LOX活性檢測

參照Axelrod等[5]的方法，略作調整，手工剝離完整的新鮮甜玉米、糯玉米籽粒，并分離得到胚組織，分別稱取籽粒及其胚5.0g左右放入研缽，加入液氮，迅速研碎，加入15mL經4℃預冷的磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH7.0)，冰浴勻漿，多次浸提后定容至25mL，取5mL 10000×g(4℃)離心30min，上清液用于LOX活性的測定。

采用3.25mL反應體系，其中磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0)2.8mL，亞油酸底物溶液0.25mL(取70mg(70μL)亞油酸加入同體積的吐溫-20，4mL無氧水，搖勻加入足量的0.5mol/L NaOH得到清亮的溶液，以0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液定容到25mL)，酶液0.2mL，在25℃條件下反應，于波長234nm測定其吸光度。加酶液15s開始計時，每10s讀數一次，記錄1min內吸光度的變化。以pH7.0的磷酸緩沖液代替酶液做空白對照。重復3次。酶活力單位(U)定義為每克樣品每分鐘吸光度的變化值。

酶活力及相對酶活力按式(1)、(2)計算。

式中：ΔA0為未經熱處理的樣品的吸光度變化值；ΔAt為熱處理t min后的樣品的吸光度變化值。

1.3.2 反應溫度實驗

將裝有磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH6.0)和亞油酸底物(8.0mmol/L)的試管置于一定溫度(40～65℃)的水浴鍋中加熱一段時間至恒溫，然后依次加入鮮食玉米胚LOX提取液進行活性測定。

1.3.3 pH值實驗

在不同pH值條件[6](pH4.0～5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 6.0～7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 8.0～9.0硼砂-硼酸緩沖液，濃度均為0.05mol/L)下，在25℃條件下測定鮮食玉米胚中LOX提取液的活性。

1.3.4 底物濃度實驗

在25℃、pH6.0的條件下，將鮮食玉米胚中LOX酶液與不同濃度(2.5～10.0mmol/L)亞油酸底物反應，測定其活性。

1.3.5 熱穩定性實驗

將鮮食玉米胚LOX提取液置于試管中，在50、55、60、65、70℃水中處理一定時間(0～24min)后，冰浴冷卻，在25℃、pH 6.0的條件下測定LOX活性。

1.4 數據分析

用Excel 2003統計分析所有數據，計算標準誤；用Origin 8.5軟件進行制圖。

式中：A(30s)為反應30s的吸光度；A(15s)為反應15s時的吸光度；m為參與反應的樣品鮮質量/g。

2 結果與分析

2.1 甜玉米、糯玉米不同部位LOX活性比較

為了簡便快速地考察不同條件下LOX的活性，常選取LOX緩沖鹽提取液作為研究對象。本實驗采用磷酸緩沖液分別提取甜玉米籽粒與胚、糯玉米籽粒與胚中的LOX，在25℃、pH6.0的條件下測定其活性，結果見圖1。

圖1 鮮食玉米不同部位LOX活性Fig.1 LOX activity in different parts of fresh corn

由圖1可知，鮮食玉米胚中LOX活性顯著高于籽粒，甜玉米胚中LOX活性為籽粒的2.2倍，糯玉米胚中LOX活性為籽粒的9.5倍。不同品種鮮食玉米不同部位的LOX活性差異顯著(P＜0.05)，糯玉米胚中LOX活性為甜玉米胚的1.3倍，而糯玉米籽粒LOX活性僅為甜玉米籽粒的30%，結果表明，不同品種鮮食玉米中LOX的空間表達特性存在較大差異。亞細胞定位研究證實，植物種子LOX主要存在于脂體、液泡、微粒體、葉綠體、質膜及胞漿[7]中，由于鮮食玉米中胚部分含有大量脂體，因此LOX活性相對較高。

2.2 反應溫度對鮮食玉米胚中LOX活性的影響

圖2 不同反應溫度下鮮食玉米胚中LOX活性Fig.2 LOX activity in fresh corn at different temperatures

由圖2可知，兩種鮮食玉米胚中LOX活性隨反應溫度的變化趨勢相似，在40～55℃范圍內，鮮食玉米LOX活性隨溫度的升高而升高，在55℃時達到最大值，當溫度高于55℃時，兩種鮮食玉米胚中LOX活性隨著溫度的升高而降低。這主要是由于一方面升高溫度加速了酶促反應的進行，另一方面升高溫度加速了酶蛋白變性[8]。Theerakulkait等[9]研究發現甜玉米LOX的最適反應溫度在50℃左右，本實驗測得的55℃與之略有差異，可能與反應體系和加熱方法不同有關。大量研究證實，多數植物LOX最適反應溫度在30～45℃之間，如青豌豆最適反應溫度為30℃[10]；香蕉葉最適反應溫度為40℃[11]，牡丹花最適反應溫度為45℃[12]。

2.3 pH值對鮮食玉米胚中LOX活性的影響

圖3 不同pH值條件下鮮食玉米胚中LOX活性Fig.3 LOX activity in fresh corn in buffers with different pH levels

由圖3可知，當pH值低于5.0時或高于9.0時，幾乎檢測不到LOX的活性；在酸性pH值范圍內，隨著pH值升高，甜玉米和糯玉米胚中LOX的活性均先升高后降低，在pH6.0時均達到最大值，此時糯玉米胚中LOX活性為甜玉米的1.33倍；在堿性pH值范圍內，隨著pH值的升高，糯玉米胚中LOX活性先升高后降低，而甜玉米胚中LOX活性一直降低。甜玉米胚中LOX的最適pH值在6.0左右，而糯玉米胚中LOX有兩個pH值活性峰，其中以pH6.0時活性較高，在pH8.0時的相對活性為pH6.0時的83.7%。類似糯玉米胚中LOX這樣有兩個pH值活性峰的情況在其他植物中也有報道。如Mahanta等[13]研究發現毛尖茶葉中LOX在pH7.5和pH9.0時有活性峰，李強等[14]證實黃瓜果實中LOX在pH7.0和pH9.0時有活性峰。

研究表明，LOX是一個多基因家族，存在多種同工酶，不同LOX的最適pH值存在差異，如目前已知的大豆LOX同工酶至少有6種，其中3種LOX-1、LOX-2、LOX-3為貯藏蛋白并主要存在于大豆種子中，LOX-1、LOX-2、LOX-3的最適反應pH值分別為9.0、6.5、7.0。本實驗中，甜玉米胚中LOX的最適pH值為6.0，其LOX類型可能與大豆LOX-2接近，糯玉米籽粒胚中LOX具有兩個較適宜反應的pH值，可能其LOX是由兩種同工酶組成的，至于這兩個活性峰所代表的是否為不同同工酶的最適pH值，還有待進一步分離各組分后再作研究。

2.4 底物濃度對鮮食玉米胚中LOX活性的影響

由圖4可知，在底物濃度2.5～8.0mmol/L時，LOX活性隨底物濃度的增加而升高；但當所加底物濃度超過8.0mmol/L后，隨著底物濃度的增加，甜玉米和糯玉米胚中LOX活性均上升不顯著(P＞0.05)。這可能是由于反應體系中底物亞油酸濃度過高時，有一部分在空氣中自動氧化為羥基過氧化物，當羥基過氧化物達到一定濃度后，抑制了LOX的活性[15]。Romero等[16]研究發現，甜玉米LOX的最適底物濃度為2.0mmol/L，本實驗結果與之存在差距，這可能與玉米品種、酶提取方法及測定體系的不同有關。

圖4 不同底物濃度條件下鮮食玉米胚LOX活性Fig.4 LOX activity in fresh corn in substrate with different concentrations

2.5 鮮食玉米胚中LOX的熱穩定性

為研究不同溫度處理對LOX的鈍化效果，將LOX提取液在特定的溫度下保溫后測定相對酶活力。以處理時間為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，結果見圖5、6。

圖5 甜玉米胚中LOX熱失活曲線Fig.5 Thermal inactivation curves of LOX in sweet corn

圖6 糯玉米胚中LOX熱失活曲線Fig.6 Thermal inactivation curves of LOX in sweet corn

由圖5～6可知，50℃處理甜玉米胚LOX時，隨時間的延長，其活性呈現波狀變化，24min內變化幅度在10%以內，表明在低于最適反應溫度時，短時間處理甜玉米胚LOX對其活性影響不大。50℃處理糯玉米胚LOX時，隨時間的延長，LOX活性呈緩慢上升而后又降低的趨勢，處理20min后，其活性可增加20%，這表明，50℃處理對糯玉米胚LOX存在一定的激活作用。由以上可知，低于最適反應溫度時處理鮮食玉米胚LOX，其自身溫度隨處理時間的延長不斷增加，反應物分子動能隨之增加，酶活性增加，低溫短時間內(小于24min)處理鮮食玉米胚LOX不會出現熱失活現象。當溫度為55℃時，隨時間的延長，甜玉米胚LOX活性逐漸降低，24min時其活性降低了90%，糯玉米胚LOX活性在24min內整體呈下降趨勢，在前12min LOX活性差異不顯著(P＞0.05)，后12min活性降低了20%。處于最適反應溫度時，隨著處理時間的變化，甜玉米胚LOX對溫度的敏感性高于糯玉米。60、65℃鈍化鮮食玉米胚LOX時，甜玉米胚LOX的熱失活曲線包含初始快速失活和慢失活階段，糯玉米胚LOX失活速率變化較小，這可能由于不同品種鮮食玉米胚LOX同工酶組成不同，而不同的同工酶具有不同的活性形式，酶失活表現為各種形式的綜合作用造成的。在70℃處理鮮食玉米胚LOX時，甜玉米和糯玉米胚LOX活性呈線性下降，甜玉米胚LOX在處理3min時，糯玉米胚LOX在處理4min時，活性均消失，出現這種變化的原因主要是高溫加速酶蛋白變性，而這種變性隨時間累積而加強。

3 結 論

鮮食玉米不同部位對LOX活性影響差異顯著，胚中LOX活性高于籽粒；酶促反應的最適溫度為55℃；甜玉米胚中LOX最適pH值為6.0，糯玉米胚中LOX活性峰分別為pH6.0和pH8.0，以pH6.0時活性較高；當亞油酸濃度為8mmol/L時，LOX被底物飽和，酶反應速度最大；甜玉米胚中LOX耐熱性高于糯玉米，提高溫度和延長處理時間能有效地鈍化LOX活性。

[1] THEERAKULKAIT C, BARRETT D M, MCDANIEL M R. Sweet corn germ enzymes affect odor formation[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(5): 1034-1040.

[2] RODRIGUEZ-SAONA L E, BARRETT D M, SELIVONCHICK P. Peroxidase and lipoxygenase influence on stability of polyunsaturated fatty acids in sweet corn (Zea mays L.) during frozen storage[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(5): 1041-1044.

[3] 胡廷章, 胡宗利, 屈霄霄, 等. 植物脂肪氧化酶的研究進展[J]. 生物工程學報, 2009, 25(1): 1-9.

[4] BSYSAL T, DEMIRD?VENB A. Lipoxygenase in fruits and vegetables: a review[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(4): 491-496.

[5] AXELROD B, CHEESBROUGH T M, LAAKSO S. Lipoxygenase from soybeans[J]. Methods in Enzymology, 1981, 71: 441-451.

[6] 陳毓荃. 生物化學實驗方法和技術[M]. 北京: 科學出版社, 2002: 218-222.

[7] 汪仁, 沈文飚, 翟虎渠, 等. 植物種子脂氧合酶[J]. 植物生理學通訊, 2005, 41(3): 388-394.

[8] 陳石根, 周濡琦. 酶學[M]. 上海: 復旦大學出版社, 2001: 199-203.

[9] THEERAKULKAIT C, BARRETT D M. Lipoxygenase in sweet corn germ: isolation and physicochemical properties[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(5): 1029-1033.

[10] G?KMEN V, BAH?ECI S, ACAR J. Characterization of crude lipoxygenase extract from green pea using a modified spectrophotometric method[J]. European Food Research and Technology, 2002, 215(1): 42-45.

[11] KUO J, HWANG A, YEH D, et al. Lipoxygenase from banana leaf: purification and characterization of an enzyme that catalyzes linoleic acid oxygenation at the 9-position[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(8): 3151-3156.

[12] 李銘韌, 史國安. 牡丹花瓣脂氧合酶測定方法的研究[J]. 山東農業科學, 2010(9): 91-93.

[13] MAHANTA P K, TAMULI P, BHUYAN L P. Changes of fatty acid contents, lipoxygenase activities, and volatiles during black tea manufacture[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 41(10): 1677-1683.

[14] 李強, 吳曉露, 李紅偉, 等. 黃瓜果實脂氧合酶活性測定方法的建立[J]. 東北農業大學學報, 2008, 39(5): 62-65.

[15] PERRAUD X, KERMASHA S, BISAKOWSKI B. Characterization of a lipoxygenase extract from Geotrichum candidum[J]. Process Biochemistry, 1999, 34(8): 819-827.

[16] ROMERO M V, BARRETT D M. Rapid methods for lipoxygenase assay in sweet corn[J]. Journal of Food Science, 1997, 62(4): 696-700.

Lipoxygenase Activity of Fresh Corn

LIU Fu-guo1,2,3，JIN Bang-quan1,*，NIU Li-ying2,3，LIU Chun-quan2,3，SONG Jiang-feng2,3，LI Da-jing2,3
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；3. Engineering Research Center for Agricultural Products Processing, National Agricultural Science and Technology Innovation Center in East China, Nanjing 210014, China)

The factors for fresh corn lipoxygenase (LOX) were investigated by using spectrophotometric assay. Using linoleic acid as the substrate and fresh sweet corn and waxy corn as samples, LOX activity was determined in reaction system with different extraction positions, enzymatic reaction pH levels and reaction temperatures and substrate concentrations. The results indicated that LOX activity in the germ was significantly higher than that in the whole kernel, and the enzyme had optimal temperature of 55 ℃, optimal pH of 6.0, and optimal substrate concentration of 8.0 mmol/L. The thermal stability of LOX was significantly inhibited by increasing temperature and prolonging heat treatment.

fresh corn；lipoxygenase；activity；characterization

TS201.2

A

1002-6630(2013)03-0198-04

2012-03-19

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(CXLX11_0894)；南京師范大學研究生科研創新計劃資助項目

劉夫國(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為食品品質學。E-mail：liufuguo@sina.cn

*通信作者：金邦荃(1956—)，女，教授，博士，研究方向為肉品學與營養學。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn