6種海洋微藻β-葡聚糖的累積特征及其免疫活性分析

田 甜，周成旭*，劉寶寧，陳海敏，嚴小軍

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

6種海洋微藻β-葡聚糖的累積特征及其免疫活性分析

田 甜，周成旭*，劉寶寧，陳海敏，嚴小軍

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

跟蹤檢測6種海洋微藻在生長過程中單位細胞β-葡聚糖的含量變化，分析其累積時期、累積速率以及提取制備的得率和純度，并對幾種微藻來源的β-葡聚糖進行免疫活性檢測。結果表明：β-葡聚糖在微藻種群增殖的平臺期累積量最大，不同種類的微藻細胞累積β-葡聚糖能力差異較大。假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)具有較大的累積速率、提取制備得率以及較大的免疫活性。6種海洋微藻來源的β-葡聚糖都顯示比酵母來源的β-葡聚糖免疫活性高。

海洋微藻；β-葡聚糖；累積效率；提取率；免疫活性

葡聚糖又稱為右旋糖酐，廣泛分布在細菌、真菌、高等植物體內，有α-葡聚糖和β-葡聚糖兩種，α-葡聚糖一般沒有生物活性，多數具有明顯生物學活性的葡聚糖都是β-葡聚糖[1]。不同來源的β-葡聚糖，其結構和生物活性都存在差異，真菌提取的如酵母β-葡聚糖，主鏈由1,3-β糖苷鍵連接，帶有由1,6-β糖苷鍵連接的分支，具有抗腫瘤活性；高等植物如燕麥β-葡聚糖，不僅帶有1,3-β和1,6-β糖苷鍵，還存在1,4-β糖苷鍵連接的分子內連接[2]，具有降低總膽固醇的作用[3]。即使是同種來源的β-葡聚糖，也可能同時具有單螺旋、三螺旋或隨機螺旋等立體構象[4]，從而表現多種生物活性，如防護系統增強劑(HDP)[5]、抗腫瘤[6]、抗感染[7]和免疫調節功能。β-葡聚糖既可作為膳食纖維來源，又是一種優質的保健食品添加劑，已被正式列入國家資源產品[8]。

海洋微藻是海洋生態系統中的最主要初級生產者，也是海洋生物資源的重要組成部分。海洋微藻生長速度快，單位面積產量大，相對于高等植物，可以更有效地利用陽光、水和二氧化碳等無機物合成有機物[9]，而且在生產過程中不占用耕地，是未來海洋資源開發的重要對象。糖類是海洋微藻重要的代謝產物，海洋微藻多糖除了具有傳統的工業價值外，還具有多種生物活性及藥用功能[10]，如增強機體免疫、抗病毒作用、抗惡性腫瘤、抗炎癥[11-15]。已有分析顯示，來源于微型藻類牟氏角毛藻的β-葡聚糖較市售產品的免疫活性高[16]。綜上所述，從微藻中提取高活性β-葡聚糖有重要科學意義。

本實驗以微型藻類生產β-葡聚糖為目標，在實驗研究的基礎上，對幾種可以快速增殖的海產微型藻類β-葡聚糖的產生規律、制備產率和產量以及生物活性等進行分析，為微藻來源β-葡聚糖的選種、采收時機選擇等方面的研究和生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種及其培養：選取6種海產微藻，均為寧波大學微藻種質庫保存種質。其中硅藻4種：中肋骨條藻(Skeletonema costatum (Greville) Cleve)、角毛藻(Chaetoceros debilis Cleve)、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bahl.)。金藻2種：等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)和一種顆石藻(Pleurochrysis sp.)。各種微藻在相同的培養條件下，用f/2培養液懸浮培養。培養環境溫度20℃、光照度2500lx(白天:黑夜=12:12)，每天搖瓶2次。每種藻設3個平行組，培養體積800mL，起始培養密度為1.9×105～2.1×105cells/mL。

1.2 試劑與儀器

β-葡聚糖標準品(純度＞95%) 武漢百特純大分子科技有限公司；玻璃纖維濾紙 英國Whatman公司；小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒 武漢博士德生物有限公司；小鼠巨噬細胞(Raw 246.7) 武漢中國典型培養物保藏中心；剛果紅 上海遠航試劑廠；Sephadex G-50美國Pharmacia公司；其余試劑均為為國產分析純。

GXZ-128A智能光照培養箱 寧波江南儀器有限公司；酶標儀 德國Thermo公司；UV-7540紫外-可見光分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；TS100倒置生物顯微鏡 日本尼康公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；BUCHI R-210/215旋轉蒸發儀上海萬捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-葡聚糖在種群生長過程中變化規律的研究

1.3.1.1 微藻種群生長過程跟蹤

以微藻懸浮液光密度值表征種群生長狀態，培養微藻至平臺期，將藻液2倍稀釋成4個梯度，取200μL各梯度藻液至96孔板，于630nm波長測吸光度；同時用血球計數板計數對應藻液細胞密度，設3個平行，繪制藻液吸光度和對應細胞數的關系曲線。樣品檢測時，取200μL藻液至96孔板，于630nm波長處測吸光度。比照吸光度與細胞數關系曲線，計算細胞數。隔天取樣，培養至20d。

1.3.1.2 種群生長過程中細胞內β-葡聚糖含量測定

參考Granum等[17]的方法，制作葡萄糖吸光度標準曲線。樣品測量時將藻液搖勻，吸取10mL藻液用玻璃纖維濾紙(Whatman CF/C)過濾，收集濾膜上的藻細胞。往藻細胞中加入5mL 0.05mol/L H2SO4，于60℃水浴加熱30min，再用玻璃纖維濾紙過濾，收集過濾液。取1mL濾液，于485nm波長處測吸光度，比照標準曲線計算相應的β-葡聚糖含量。隔天取樣，培養至20d。

1.3.2 β-葡聚糖制備及其得率分析

1.3.2.1 β-葡聚糖的提取制備

按上述條件培養微藻至平臺期，4℃、4800r/min離心10min，收集藻細胞，冷凍干燥收集干藻粉。稱取一定量的各種藻粉，按照Hirokawa等[18]的方法提取葡聚糖，得到淡黃色蓬松纖維狀葡聚糖粗糖。

參考何貺等[19]的方法：取粗糖溶解后進行Sephadex G-50柱層析純化，以純水洗脫，控制流速大約0.25mL/min，每管收集2.5mL分部收集。每管吸取少量收集液用苯酚-硫酸法檢測，按照管號對光密度繪制洗脫曲線，將最大峰處的洗脫液合并，旋轉蒸發，冷凍干燥，得到淡黃色粉末狀葡聚糖純糖。

1.3.2.2 β-葡聚糖的含量測定

剛果紅法測β-葡聚糖含量：剛果紅與β-葡聚糖反應具有高度專一性，形成有色物質，當反應條件一致時，溶液中β-葡聚糖含量在一定范圍內吸光度變化與β-葡聚糖濃度成正比[20]，本研究以剛果紅法檢測粗糖樣品中β-葡聚糖純度。參考張娟等[21]的方法制作葡聚糖光密度標準曲線，樣品檢測時稱取0.005g樣品，加少量去離子水，70℃水浴助溶，再加去離子水至體積為10mL配成500μg/mL的樣品液，冰箱儲存備用。測量時，取80μL的樣品液，添加去離子水至體積為1mL，配成40μg/mL葡聚糖溶液，再加入2mL剛果紅溶液，20℃水浴加熱30min后取1mL于545nm波長處測吸光度，比照標準曲線計算樣品液β-葡聚糖含量。

1.3.3 β-葡聚糖免疫活性檢測

1.3.3.1 細胞培養

取小鼠巨噬細胞Raw 264.7細胞液1mL/孔于24孔板，37℃培養24h，控制細胞數為2×105cells/mL，再依次加入5、10、20μL 10mg/mL β-葡聚糖溶液，形成50、100、200μg/mL的質量濃度梯度，留一個孔的細胞液不加葡聚糖作空白對照，培養24h后取出備用。

1.3.3.2 免疫活性檢測

收集細胞液，4℃、5000r/min離心5min，取上清液，按照小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒說明書操作ELISA實驗。每組做2個平行。

1.4 數據分析

實驗數據采用x±s表示。

圖1 6種海產微藻培養增殖過程中細胞數和單位細胞β-葡聚糖含量變化特征Fig.1 Population growth and cellular β-glucan content variations in different species of marine microalgae

2 結果與分析

2.1 微藻培養過程中β-葡聚糖含量變化特征

由圖1可知，比較6種海洋微藻在種群生長過程中單位細胞β-葡聚糖含量變化趨勢，受初始接種微藻狀態的影響，種群生長初期即在新的營養條件下都表現為胞內β-葡聚糖降低，指數增長期中出現β-葡聚糖的最低值，以后各藻細胞中β-葡聚糖逐漸累積，到平臺期后期或衰亡期β-葡聚糖累積得最多。在進入平臺后期(或衰亡期)后，三角褐指藻、假微型海鏈藻和等鞭金藻細胞內β-葡聚糖含量持續增加，中肋骨條藻、角毛藻和顆石藻單位細胞β-葡聚糖含量的增加則趨于平緩。顯示了不同種類對β-葡聚糖的代謝利用特征上的差異。

表1 海產微藻單位細胞β-葡聚糖含量最小、最大值及累積倍增效率Table1 Maximum and minimum contents and cumulative doubling efficiency of β-glucans from different species of marine microalgae at the same culture

進一步分析各種增殖培養過程中β-葡聚糖從最小值至最大值的累積效率。從表1可以看出，在相同培養條件下，不同微藻β-葡聚糖的累積量差異明顯。分析微藻種群增殖過程中，單位細胞β-葡聚糖含量從最低到最高變化過程發現，假微型海鏈藻單位β-葡聚糖增加倍數最大，為1002.5%，增加速率最快，平均達71.61%/d，而其他微藻的增加倍率在200%～500%之間。顯示假微型海鏈藻細胞β-葡聚糖與生長代謝關系密切，利用其生產β-葡聚糖的可調節程度高。

2.2 β-葡聚糖的得率和純度分析

得率和純度都能反映提取方法的提取效率。由表2可見，中肋骨條藻、三角褐指藻、角毛藻和等鞭金藻提取β-葡聚糖的得率在0.2%以上、純度在91%以上，假微型海鏈藻和顆石藻提取β-葡聚糖的得率分別為0.346%和0.329%，純度分別為93.99%和94.21%，相對于其他微藻的得率和純度都較高。總體來說，6種海產藻β-葡聚糖提取得率、純度跟平均值比較差距相對不大，可能是因為提取方法一樣。關于β-葡聚糖提取的方法較多，主要的提取方法有酸堿法[22]、酶法[23]等，比較Wood等[24]溫和堿法提取燕麥β-葡聚糖的得率達0.7%，純度低于90%，本提取方法提取β-葡聚糖的純度較高，提取得率卻比較低，今后需要改進提取條件進一步提高得率。

表2 海產微藻β-葡聚糖提取效率Table2 Extraction efficiency ofβ-glucans from different species of marine microalgae

2.3 β-葡聚糖免疫活性檢測

腫瘤壞死因子(TNF-α)是目前發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子，它可以調節腫瘤細胞的生長。很多細胞都可以合成TNF-α，包括各種免疫細胞，如單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞等。將不同濃度的海洋微藻β-葡聚糖作用于小鼠單核巨噬細胞(RAW246.7)，通過ELISA實驗觀察β-葡聚糖誘導TNF-α生成量的變化，結果如圖2所示。

圖2 6種海洋微藻的生成量Fig.2 Production of TNF-α induced by β-glucans at different concentrations from different species of marine microalgaeβ-葡聚糖在不同濃度下誘導TNF-α

將6種海產微藻β-葡聚糖作用于小鼠巨噬細胞均誘導TNF-α生成量的增加，由此可以推測海產微藻β-葡聚糖有具有激活巨噬細胞、促進細胞因子合成和抗腫瘤等生物學活性[25]。比較不同質量濃度β-葡聚糖對Raw264.7細胞生成TNF-α量的影響，不同微藻來源的β-葡聚糖有質量濃度相關的不同效應。對中肋骨條藻和顆石藻來源而言，TNF-α生成量隨β-葡聚糖質量濃度增加而增加，在200μg/mL時TNF-α生成量最大；角毛藻和假微型海鏈藻的β-葡聚糖質量濃度在100μg/mL時TNF-α生成量達到飽和，β-葡聚糖質量濃度為200μg/mL TNF-α生成量跟100μg/mL沒有顯著差別；三角褐脂藻和等鞭金藻的β-葡聚糖質量濃度為100μg/mL時TNF-α生成量最大，當質量濃度為200μg/mL TNF-α生成量反而下降，顯示了免疫抑制的特點。

由圖3可知，比較相同質量濃度(100μg/mL)的幾種海洋微藻β-葡聚糖誘導TNF-α增加量，三角褐指藻來源的β-葡聚糖活性最大，角毛藻來源的β-葡聚糖活性最小，其他微藻來源的β-葡聚糖誘導TNF-α生成量在600～700pg/mL。與陳璐等[26]100μg/mL酵母β-葡聚糖誘導TNF-α最大增加量為232.18pg/mL相比，相同濃度海洋微藻β-葡聚糖誘導TNF-α增加量是酵母β-葡聚糖的2.5～3.2倍，所以海洋微藻來源的β-葡聚糖抗腫瘤活性高于酵母β-葡聚糖。

增加量的比較Fig.3 Comparison of TNF-α production induced by 100 μg/mL β-glucans from different origins圖3 100μg/mL不同來源的β-葡聚糖誘導TNF-α

3 結 論

3.1 海產微藻細胞的β-葡聚糖在種群增殖過程中都發生變化，在平臺后期達到最大累積。

3.2 由于海洋微藻生長及代謝的差異，使不同海洋微藻在種群生長過程中β-葡聚糖的累積特征和累積效率有所差別，并且其免疫活性也有所不同。但相同質量濃度下，海產微藻來源β-葡聚糖的免疫活性均比酵母來源的β-葡聚糖活性高。

3.3 假微型海鏈藻β-葡聚糖的累積速率和提取效率明顯高于其他海洋微藻；三角褐指藻提取的β-葡聚糖免疫活性最高，這兩種藻都可能成為今后β-葡聚糖重要的微藻來源。

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Accumulation Features and Immuno-stimulative Effects of β-Glucans from Six Species of Marine Microalgae

TIAN Tian，ZHOU Cheng-xu*，LIU Bao-ning，CHEN Hai-min，YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The accumulation features of microalgal β-glucans, including accumulation phase and rate, have been characterized by monitoring the content of β-glucans from six marine microalgae during their growth cycles. The extraction and immuno-stimulative effects of β-glucans were also studied. The results indicated that the content of cellular β-glucans reached the maximum level at stationary phase for all microalgae, however, with large variation depending on species. Among six microalgae, Thalassiosira pseudonana showed outstanding features for its β-glucans with high accumulation rate, isolation yield, and significant immuno-stimulative effects. Therefore, the immuno-stimulative effects of β-glucans were higher from microalgae than that from yeast.

marine microalgae；β-glucans；accumulative rate；extraction rate；immune activity

Q945.79

A

1002-6630(2013)03-0188-05

2012-10-20

教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”項目(IRT0734)；國家自然科學基金項目(31172448)；浙江省重點基金項目(Z3100565)；浙江省自然科學基金項目(LY12D06001)；海洋可再生能源專項資金項目(GHME2001SW02)；國家公益性行業(海洋)科研專項(201105009)

田甜(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為微型藻類生理生態學。E-mail：liazajoy@163.com

*通信作者：周成旭(1968—)，女，副研究員，碩士，研究方向為海洋微型藻類的基礎研究及應用。E-mail：zhouchengxu@nbu.edu.cn