嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混菌生物膜發酵特性及其抗逆性

瑪依諾·木圖拉，王 坤，陳曉紅，姜 梅，李 偉，董明盛,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混菌生物膜發酵特性及其抗逆性

瑪依諾·木圖拉1,2，王 坤1，陳曉紅1，姜 梅1，李 偉1，董明盛1,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

利用掃描電子顯微鏡對嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)在不銹鋼網布及椰果粒表面形成的混菌生物膜進行觀察，并對不銹鋼網布表面混菌生物膜發酵特性及其抗逆性進行研究。結果表明：Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus可在兩種載體表面形成典型的混菌生物膜結構，且不銹鋼網布表面混菌生物膜的發酵液菌體密度變化曲線與細菌S型生長曲線相似，但在停滯期和對數期不明顯，發酵液pH值呈現先下降后趨于平穩的趨勢，終止pH值接近4.0；此外，不銹鋼網布表面混菌生物膜比游離乳酸菌具有更強的抗性，并且可在15d內穩定地釋放較高濃度的游離乳酸菌。

乳酸菌；生物膜；發酵

細菌生物膜(biofilm)是一種附著于細菌體表或界面由細菌群體和包裹菌體的水合性基質組成的聚合體[1-2]，生物膜成熟后可以釋放游離菌體。與普通游離細菌相比，生物膜細菌和生物膜釋放細菌具有較強的抗逆性。由于生物膜細菌在生理、代謝、對底物的降解或利用和對環境的抵抗能力等方面具有獨特的性質[3-5]，生物膜的研究近年來備受重視。

目前，細菌生物膜已在多個領域被廣泛研究和應用，如環境修復工程(水體脫氮[6]、生物修復、吸附重金屬[7])和能源產業(氫氣制造[8])。然而，關于乳酸菌生物膜方面的研究和應用還相對較少，Speranza等[9]研究利用乳酸菌生物膜來控制軟質干酪中李斯特氏菌的生長，Rangaswamy等[10]研究過利用德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii)生物膜來連續生產乳酸。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是益生菌典型代表，廣泛應用于工業生產，利用其生物膜或生物膜釋放菌體進行生產，既可以獲取優良菌體又可以節約發酵劑，提高經濟效益。本實驗以保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的混菌生物膜為研究對象，對其結構、發酵特性、抗逆性及其作為連續接種源的可能性進行研究，以期為乳酸菌混菌生物膜在未來的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

不銹鋼網布(300目) 河北省安平縣天瑞金屬制品廠；椰果粒 福建省泉州喜多多食品有限公司。載體規格見表1。載體使用前先在95%乙醇中浸泡30min，然后再用無菌生理鹽水浸泡清洗數次以除去殘留乙醇。

表1 載體規格Table1 Specification of carriers

1.2 菌種、培養基與試劑

嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、保加利亞乳桿菌(L. bulgaricus)為南京農業大學食品微生物實驗室自行分離和保存。

MRS液體培養基：參照文獻[11]方法配制。

2.5 %戊二醛溶液[11]；生理鹽水；LIVE/DEAD Baclight熒光染色試劑盒 美國Molecular Probes公司。

1.3 儀器與設備

UP3200H超聲波清洗器 熊貓集團南京電子計量有限公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Leica TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；GJB發酵控制系統 江蘇大學生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 混菌生物膜的培養

采用置片法[12]培養混菌生物膜：將處理后的不銹鋼網布和椰果粒置于無菌MRS液體培養基中，按酸乳生產接種時1:1(V/V)的比例，以1%接種量接種S. thermophilus和L. bulgaricus，37℃靜置培養，每24h更換一次新鮮培養基，連續培養7d，使其在載體表面形成成熟生物膜。

1.4.2 混菌生物膜的觀察

將樣品用2.5%戊二醛溶液固定，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

1.4.3 混菌生物膜的發酵實驗

首先向2.5L小型發酵罐中注入2L MRS液體培養基，然后接入S.thermophilus和L.bulgaricus(接菌比例、接種量同上)，37℃靜置培養2d后每24h更換一次新鮮培養基，在轉速105r/min、37℃條件下繼續培養5d以形成成熟生物膜。生物膜形成后先用2.5L生理鹽水連續清洗發酵罐2次，再加入2L MRS新鮮液體培養基開始發酵：24h之前，每2h取一次樣，之后每4h取一次樣。對樣品進行pH值和菌體密度的測定。

1.4.3.1 發酵液pH值的測定

發酵液pH值由發酵控制系統配備pH探頭直接測得。

1.4.3.2 發酵液菌體密度的測定

菌體密度采用平板計數法測定，根據稀釋倍數和涂布取樣量即可換算出樣品的含菌量[13]，以每毫升樣品的菌落數(CFU/mL)表示。

1.4.4 不銹鋼網表面混菌生物膜的抗性研究

1.4.4.1 混菌生物膜抗性實驗

首先將3片附有成熟混菌生物膜的不銹鋼網布用無菌生理鹽水清洗3次，然后分別裝入3個盛有10mL 50℃無菌MRS液體培養基的三角瓶中水浴5min，結束后立即取出網布置入另一相同三角瓶中，室溫超聲波(200W)處理3min[14]，取三角瓶中液體計菌數。對照為37℃條件下相同處理。pH 2.0條件下的抗性實驗同上。

1.4.4.2 懸浮液混菌抗性實驗

取37℃條件下培養18h的游離混菌菌液10mL離心5min(6000r/min、4℃)，然后棄去上清向菌體沉淀中加入10mL 50℃無菌MRS液體培養基，迅速取出5mL移入10mL無菌離心管并混勻取樣0.5mL計數，其余部分50℃水浴5min后計數。pH 2.0條件下的抗性實驗同上。抗性強弱依據處理后菌體存活率大小確定。

1.4.5 乳酸菌混菌生物膜作為連續接種源的研究

待攪拌槳上形成成熟的混菌生物膜后，對生物膜釋放游離菌體的能力進行測定。具體方法如下：排出發酵液后，首先用無菌生理鹽水將發酵罐連續沖洗3次，以洗掉表面附著菌體。然后向發酵罐中注入2L無菌生理鹽水(105r/min，37℃)，3min后排出液體并取樣計數。此步驟重復進行5次。計數完畢，重新向發酵罐中注入2L新鮮MRS液體培養基，培養24h(105r/min，37℃)。此即為一個循環。實驗共15個循環。

2 結果與分析

圖1 椰果粒(a)和不銹鋼網布(b)載體上混菌生物膜電子顯微鏡圖Fig.1 Images of mixed-species biofilm on different carriers examined by SEM

2.1 混菌生物膜的電鏡觀察結果由圖1可知，S. thermophilus和L. bulgaricus在兩種載體表面上可以形成典型的混菌生物膜，菌體與菌體之間緊密排列，共同粘聯在載體表面。同時，生物膜的典型結構——生物膜孔道(圖中空隙部分，用于細胞之間營養物質的傳送和代謝廢物的排出)也清晰可見。至此可知S. thermophilus和L. bulgaricus可以在不銹鋼網布和椰果粒表面形成典型的混菌生物膜。

2.2 混菌生物膜發酵液菌體密度的變化

圖2 混菌生物膜發酵液菌體密度變化曲線Fig.2 Change curve of bacterial colony number in the broth fermented by mixed-species biofilm

由圖2可知，0～20h時，菌體密度增速較快，24h后，菌體密度達到最大值(超過108CFU/mL)并基本趨于平穩，而28h后有略微下降趨勢。混菌生物膜發酵液菌體密度變化曲線和細菌S型生長曲線比較相似，但停滯期和對數期不明顯。分析其原因，可能是因為成熟生物膜可以持續釋放菌體，但釋放菌體對環境的適應還需要一定時間，而一定環境的細菌容納量是有限的，這就造成發酵液菌體密度接近最高時而大部分釋放菌體尚未達到最大活力，所以停滯期和對數期不明顯。

2.3 混菌生物膜發酵液pH值的變化

圖3 乳酸菌混菌生物膜發酵液pH值變化曲線Fig.3 pH change curve of the broth fermented by mixed-species biofilm

由圖3可知，隨著時間的延長，發酵液pH值呈逐漸下降的趨勢，24h后下降趨勢變緩，有趨于平穩的態勢，發酵液終止pH值接近4.0。這與游離保加利亞乳桿菌32h發酵液pH值差異不大(3.96)[15]，說明生物膜乳酸菌與游離乳酸菌具有相似的產酸能力。

2.4 混菌生物膜和游離菌體抗性實驗結果

圖4 不同條件下游離細菌與不銹鋼網布表面混菌生物膜菌體存活率的比較Fig.4 Comparison of survival rates between planktonic and mixedspecies biofilm on stainless steel under different conditions

由圖4可知，不銹鋼網布表面混菌生物膜在50℃和pH2.0條件下處理5min 后，菌體存活率分別為72.4%和44.5%遠大于混菌懸浮液菌體的26.37%和6.2%。說明混菌生物膜菌體比游離菌體具有更強的抗逆性。

2.5 乳酸菌混菌生物膜釋放游離菌計數

圖5 乳酸菌混菌生物膜釋放游離菌數變化曲線Fig.5 Change curve of free bacteria released by mixed-species biofilm

由圖5可知，在15次循環中，乳酸菌混菌生物膜每次沖洗時釋放的游離菌數都在106CFU/mL或106CFU/mL以上，雖然每次循環隨著沖洗次數的增加，菌體濃度有略微下降趨勢，但幅度并不明顯，說明乳酸菌混菌生物膜具有較高和穩定的菌體釋放能力，具有作為連續接種源的潛力。

3 結 論

利用掃描電子顯微鏡對S. thermophilus和L. bulgaricus在不銹鋼網布和椰果粒表面形成的乳酸菌混菌生物膜進行了觀察，結果表明，S.thermophilus和L.bulgaricus可在不銹鋼網和椰果粒表面可以形成典型的混菌生物膜，然后對不銹鋼網布表面混菌生物膜的發酵特性進行了研究，發現不銹鋼網布表面混菌生物膜發酵液菌體密度變化曲線類似細菌S型生長曲線，但在停滯期和對數期不明顯，生物膜乳酸菌發酵液pH值呈現先下降后趨于平穩的趨勢，終止pH值接近4.0，賀銀鳳等[16]對乳酸菌固定化工藝參數及發酵特性進行研究時固定化乳酸菌發酵牛乳pH值變化趨勢與此相似。除此之外，本實驗對乳酸菌混菌生物膜的抗逆性和釋放菌體的能力也做了一些研究，發現乳酸菌混菌生物膜具有較高的抗性并能穩定地釋放菌體，這為乳酸菌混菌生物膜在未來的應用提供了可能。

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Fermentation Performance and Resistance of Biofilm Formed by Mixed Bacterial Strains of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

Mahinur·MUTUVULLA1,2，WANG Kun1，CHEN Xiao-hong1，JIANG Mei1，LI Wei1，DONG Ming-sheng1,*

(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Life Sciences, Xinjiang Normal University, ürümqi 830052, China)

In this study, the biofilm on coconut or stainless mesh formed by mixed bacterial strains such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus was observed by scanning electron microscope, and then the preliminary study on fermentation performance and resistance of the generated biofilm on stainless mesh was conducted. The results showed that S. thermophilus and L. bulgaricus could form typical mixed-species biofilm on coconut and stainless mesh, and the change curve of bacterial density from the broth fermented by mixed bacterial strains on stainless mesh was S-shaped growth curve, while the lag phase and logarithmic phase was not obvious. The pH of the broth fermented by mixed-species biofilm revealed a decrease in the early stage and then a stable level in the late stage with the final pH close to 4.0. In addition, the mixed-species biofilm had stronger resistance than free bacteria.

lactic acid bacteria；biof i lm；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2013)03-0169-04

2012-02-24

國家“863”計劃項目(2011AA100903)；江蘇省自然科學基金項目(BK2011651)；教育部博士點基金(新教師類)項目(20110097120028)；南京農業大學青年科技創新基金項目(KJ2010018)

瑪依諾·木圖拉(1982—)，女，碩士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：849180636@qq.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dongms@njau.edu.cn