響應面法優化雙歧桿菌B04代謝產細菌素的發酵條件

劉國榮，張郡瑩，王成濤，李平蘭*，任 麗

(1.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

響應面法優化雙歧桿菌B04代謝產細菌素的發酵條件

劉國榮1，張郡瑩1，王成濤1，李平蘭2,*，任 麗1

(1.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

以分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道的產細菌素動物雙歧桿菌(Bif i dobacterium animal)B04為研究對象，以單核細胞增生李斯特菌為細菌素抑菌活性測試指示菌，以相對抑菌效價為考察指標，對雙歧桿菌菌株B04所產細菌素的發酵條件進行優化。首先考察不同接種量、培養時間、培養溫度及起始pH值4個因素對細菌素合成的影響，確定培養時間、培養溫度及起始pH值3個因素對細菌素的相對抑菌效價影響較為顯著，故再選取這3個因素進行響應面試驗優化。獲得優化后的最佳培養條件確定為：接種量1%、起始pH 6.3、培養溫度36℃、培養時間29h。在此優化條件下，細菌素相對抑菌效價高達3479.25AU/mL，比優化前(1032.66AU/mL)提高了2.37倍。同時，最優發酵條件下獲得的實驗結果與模型預測值相吻合，說明所建立的回歸模型是切實可行的。

響應面；細菌素；動物雙歧桿菌；發酵條件

乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體機制合成并分泌到環境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質，它在人體內可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優點，已成為天然食品生物防腐劑研究與開發的熱點[1-2]。然而，由于受到培養條件、細菌生長期及自身誘導肽的調控，乳酸菌代謝產細菌素的水平往往很低，嚴重制約了細菌素的工業化生產及應用[2-5]。

雙歧桿菌(Bifodobacterium spp.)是寄生在人和動物腸道內的典型有益乳酸菌，它可以對宿主發揮生物屏障、營養、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。已報道[6-9]有少數雙歧桿菌屬菌株也可產生細菌素，如兩歧雙歧桿菌(B. bif i dum)、動物雙歧桿菌(B. animals)、嬰兒雙歧桿菌(B. infants)、嗜熱雙歧桿菌(B. thermophilum)等。

動物雙歧桿菌(B. animal)B04分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道，是國內首次報道的產細菌素雙歧桿菌菌株[7]。前期對該菌株所產細菌素的抑菌特性進行研究，發現其有非常良好的食品加工特性，同時抑菌譜較廣，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應用潛力。本研究以該菌株為研究對象，通過單因素試驗和響應面法優化發酵條件，獲得該菌代謝產生細菌素的最優發酵參數，為該菌株在工業上大量生產細菌素提供一定的實踐基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基與試劑

產細菌素動物雙歧桿菌B04分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道，由中國農業大學食品微生物實驗室提供。指示菌單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 35152由加拿大食品安全研究所Mansel Griffiths教授提供。

雙歧桿菌培養基(TPY培養基)、指示菌培養基(TSYEA固體培養基、TSYEB液體培養基) 北京陸橋技術有限公司。

乳酸鏈球菌素Nisin(1×106IU/g) 美國Sigma公司；HCl、NaOH均為分析純。

1.2 發酵上清液的制備

按1%的接種量將菌株B04接種于新鮮的TPY培養基中，37℃條件下靜置厭氧培養。24h后結束培養，8000r/min離心10min去除菌體細胞，調上清液pH值至7.0左右后，對其進行抑菌活性檢測。

1.3 抑菌活性的測定

采用牛津杯雙層瓊脂平板擴散法測定中和后發酵上清液的抑菌活性[10]。采用標準曲線法測定細菌素的相對抑菌效價[11-12]，具體為：以單核細胞增生李斯特菌ATCC 35152為指示菌，以乳酸鏈球菌素Nisin為陽性對照，首先制作細菌素相對抑菌效價標準曲線，然后將待測發酵上清液的抑菌圈直徑代入效價回歸方程：y=0.2009x+2.8876(R2=0.9939)，其中y表示相對抑菌效價的對數值；x表示抑菌圈直徑/mm。計算發酵液中細菌素的相對抑菌效價。

1.4 單因素試驗

選擇接種量、發酵起始pH值、培養溫度、培養時間作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選取響應面試驗的因素和水平。

1.4.1 接種量的影響

分別以0.5%、1%、3%、5%、10%的接種量接種動物雙歧桿菌B04，發酵起始pH 值為7.0、培養溫度37℃、培養時間24h。發酵結束后，取樣并測定發酵液的抑菌活性。

1.4.2 發酵起始pH值的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04，發酵起始pH 值分別設為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0，培養溫度37℃、培養時間24h。發酵結束后，取樣并測定發酵液的抑菌活性。

1.4.3 培養溫度的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04，發酵起始pH 6.5，培養溫度分別設為25、30、37、40、45℃，培養時間24h。發酵結束后，取樣并測定發酵液的抑菌活性。

1.4.4 培養時間的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04、發酵起始pH 6.5、培養溫度30℃，分別在不同培養時間(0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、48、60、100h)取樣并測定發酵液的抑菌活性和活菌數。

1.5 響應面優化

根據單因素試驗結果，選取發酵起始pH值(X1)、培養溫度(X2)、培養時間(X3)3個因素為自變量，以相對抑菌效價為響應值，進行中心組合試驗設計。每個試驗重復3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。將實驗后的數據進行多元回歸擬合，并對回歸方程進行方差分析及擬合度檢驗，討論模型所在響應面特征，預測響應值是否為極大值、極小值，或是鞍點。若為極值，則進行驗證；若為鞍點，則進行脊嶺分析，確定在何處進行實驗可得到最好結果。

表1 試驗因素水平及編碼Table1 Factors and levels of central composite design

1.6 模型的驗證

通過響應面法優化動物雙歧桿菌代謝產細菌素的發酵條件，并以優化后的條件參數進行發酵實驗，比較模型預測值和實驗值，驗證模型的有效性。

1.7 數據處理與分析

每個實驗重復3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003統計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.05軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌B04產細菌素單因素試驗結果

2.1.1 接種量的影響

圖1 不同接種量對動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on bacteriocin production from B. animals B04

由圖1 可知，接種量為1%時該細菌素的抑菌活性較高，但是方差分析結果顯示不同接種量對該細菌素的合成影響并不顯著(P＞0.05)，這可能是由于細菌素是細菌生長到一定階段，為適應環境變化而產生的，它的合成是受菌體細胞群體感應調節的[5]。雖然試驗最開始采用了不同的接種量，但是在發酵24h后，各處理菌體數量基本一致，所以細菌素的代謝合成量也差異不大。鑒于此結果，在后期的響應面優化試驗中未選擇接種量作為考察因素。

2.1.2 起始pH值的影響

圖2 不同起始pH值對動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的影響Fig.2 Effect of initial pH on bacteriocin production from B. animals B04

由圖2 可知，發酵起始pH值對該菌株產細菌素的影響較為顯著(P＜0.05)，當發酵起始pH值在4.5～6.5范圍內時，菌株B04代謝產細菌素的抑菌活性迅速增加，當發酵pH值為6.5時抑菌圈直徑達到最大。之后，隨發酵pH值的繼續升高，抑菌活性呈逐漸下降趨勢。這可能是由于某些酸性或堿性條件使得細菌素的轉錄翻譯過程受阻，也可能與不同pH值條件下，菌體細胞對細菌素的吸附能力不同有關。根據相對抑菌效價的測定結果，確定該菌株產生細菌素的最適起始pH值為6.5，并選擇起始pH 6.5作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

2.1.3 培養時間的影響

由圖3可知，菌株B04在對數生長期(9h)開始產生細菌素，進入穩定期后細菌素產量持續增加，30h時細菌素的效價值達到最大值。此后，細菌素的產量不斷地下降。通常認為細菌素的產生與生長相關聯，有些細菌素在細胞開始生長時即可產生，而有些細菌素則在對數生長后期或穩定期才會產生。該細菌素在生長到一定時間(48h)后抑菌活性明顯降低，這可能是由于菌體生長進入衰亡期，生長環境改變，使菌體發生自溶，釋放的蛋白酶降解了部分細菌素，使其效價降低。也可能是由于發酵后期產酸積累較多，使得細菌素被吸附到產生菌細胞表面，引起發酵液中細菌素效價降低[13-14]。相對抑菌效價的測定結果顯示，菌株B04產細菌素的最適培養時間為30h。本實驗中，不同培養時間下，菌株B04所產細菌素的抑菌活性存在有顯著差異(P＜0.05)，因而，選擇培養時間30h作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

圖3 動物雙歧桿菌B04的生長及抑菌活性曲線Fig.3 Growth and bacterial inhibitory curves of B. animals B04

2.1.4 培養溫度的影響

圖4 不同培養溫度對動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from B. animals B04

由圖4可知，不同的培養溫度對細菌素的產量有較大影響(P＜0.05)。當菌株B04的培養溫度為25℃時，細菌素產量很少，抑菌活性僅為250.72AU/mL。隨著溫度的升高，細菌素的抑菌活性不斷增強，當溫度為37℃時，抑菌活性達到最高(2704.2AU/mL)，然而，隨著溫度的繼續升高，細菌素產量明顯下降。因此，確定菌株B04合成細菌素的最適溫度為37℃，并選擇其作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

現已報道的各種細菌素產生的最適培養溫度差異較大，如戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)31-1產細菌素的最佳培養溫度為30℃[15]，擴展短桿菌(Brevibacterium linens) ATCC 9175在28℃時細菌素的產量最高[16]，屎腸球菌(Enterococcus faecium)RZS C5產細菌素的溫度則必須控制在35℃[17]等。從這些研究結果不難發現，菌株產細菌素的最適溫度同菌株生長最適溫度存在偏差，這也充分說明雖然細菌素的產生與菌株的生長狀況是密切相關的[13,18]，但是菌體生長的最適溫度不一定適合細菌素的生成。已有少數學者研究[13-14]發現，細菌素在低于菌體最適生長溫度的條件下產量較高，并推測細菌素的產生是一種對不適于其生長環境的一種應激反應，稍低于最適生長溫度的生長條件能夠刺激菌體細胞產生細菌素。

2.2 雙歧桿菌B04產細菌素響應面優化結果

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

采用中心組合試驗設計，方案及結果見表2。用Design Expert 8.05軟件對表中數據進行多元回歸擬合，得到雙歧桿菌B04所產細菌素相對抑菌效價(Y)對起始pH值(X1)、培養溫度(X2)、培養時間(X3)的多項回歸方程為：

Y=3412.20—233.25X1—654.00X2—198.75X3+420.25 XX+17.25XX+58.75XX—951.98X2—1526.47X2—12132312612.97 X23

表2 中心組合試驗方案及結果Table2 Design and results of central composite tests

2.2.2 回歸模型方差分析

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。可以看出，回歸模型的P = 0.0009，失擬項的P = 0.3770，模型回歸極顯著，失擬檢驗不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾很小，不需要引入更高次數的項，模型適當。同時，該模型的決定系數為0.9735，說明該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了細菌素抑菌活性與培養基起始pH值、培養溫度、培養時間的關系，因此可用該模型對雙歧桿菌B04代謝產細菌素的培養條件進行分析和預測?；貧w方程中各變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則相應變量的顯著程度越高。由回歸方程系數顯著性檢驗可知：模型一次項X2極顯著，X1、X3不顯著；二次項X12、X22均處于極顯著水平，X32處于顯著水平；交互項X1X3、X1X2、X2X3均不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 響應曲面圖及其等高線

圖5 起始pH值和培養溫度對菌株B04代謝產細菌素影響的響應面立體分析圖及等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between innitial pH and fermentation temperature on bacteriocin production

圖6 起始pH值和培養時間對菌株B04代謝產細菌素影響的響應面立體分析圖及等高線Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between innitial pH and fermentation time on bacteriocin production

圖7 培養溫度和培養時間對菌株B04代謝產細菌素影響的響應面立體分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and fermentation time on bacteriocin production

由回歸方程所作的響應面立體分析圖及其等高線如圖5～7所示，它們分別反映了起始 pH值、培養溫度、培養時間這3個因素的兩兩交互作用對響應值的影響。通過方程可知，二次項的系數均為負值，其所表征的拋物面開口向下，具有極大值點。利用Design Expert 軟件，進行分析計算，可得合成細菌素的最佳培養條件為：初始pH6.33、培養溫度36.17℃、培養時間29.4h，在此條件下細菌素的相對抑菌效價預測值為3503.49AU/mL。結合實際操作的方便和方差分析結果，確定最佳培養條件為：起始pH6.3、培養溫度36℃、培養時間29h。

2.2.4 回歸模型的驗證

為了進一步驗證預測值，利用優化后確定的培養條件進行3 次重復搖瓶實驗，細菌素相對抑菌效價的平均值為3479.25AU/mL，與預測值擬合率達99.31%，表明預測值和實際值有良好的擬合性，優化模型可靠。同時，優化后的細菌素相對抑菌效價(3479.25AU/mL)比優化前(1032.66AU/mL)提高了2.37倍，說明本實驗所確定的優化方案的設計合理有效，所獲得的培養條件能夠明顯提高細菌素的產量。

3 結 論

3.1 單因素優化試驗結果顯示：動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的最佳接種量1%、最佳起始pH6.5、最佳培養時間30h、最佳培養溫度37℃。

3.2 在單因素試驗基礎上，利用響應面法對動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的發酵條件進行了優化，建立了細菌素相對抑菌效價與培養基起始pH值、培養溫度、培養時間3個因素的二次多項式回歸模型，經驗證實驗證明該模型合理可靠。

3.3 確定動物雙歧桿菌B04代謝產細菌素的最佳培養條件為：起始pH6.3、培養溫度36℃、培養時間29h、接種量為1%。在此條件下，細菌素相對抑菌效價高達3479.25AU/mL，較優化前提高了2.37倍。

[1] CLEVELAND J, MONTVILLE T J, NES I F, et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 71: 1-20.

[2] DEEGAN L H, COTTER P D, HILL C, et al. Bacteriocins: biological tools for bio-preservation and shelf-life extension[J]. International Dairy Journal, 2006, 16: 1058-1071.

[3] 郭興華. 益生乳酸細菌/分子生物學及生物技術[M]. 北京: 科學出版社, 2008: 219-385.

[4] 張大為, 張潔, 鄺仁亮. 產細菌素的嗜酸乳桿菌WS發酵動力學模型的建立[J]. 農業工程學報, 2008, 24(3): 295-297.

[5] 滿麗莉, 孟祥晨, 王輝, 等. 群體感應系統在乳酸菌產細菌素中的作用[J]. 食品科學, 2011, 32(13): 360-364.

[6] YILDIRIM Z, JOHNSON M. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bif i dum NCFB 1454[J]. Journal of Food Protection, 1998, 6(1): 47-51.

[7] 劉國榮, 暢曉淵, 吳寒宇, 等. 長壽老人源產細菌素乳酸菌的篩選與分子生物學鑒定[J]. 中國微生態學雜志, 2009, 21(2): 100-103.

[8] CHEIKHYOUSSEF A, POGORI N, CHEN H Q, et al. Antimicrobial activity and partial characterization of bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS) produced by Bifidobacterium infantis BCRC 14602[J]. Food Control, 2009, 20(4): 553-559.

[9] COLLADO M C, HERNANDEZ M, SANZ Y. Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bif i dobacterium strains[J]. Journal of Food Protection, 2005, 68(5): 1034-1040.

[10] 呂燕妮. 戊糖乳桿菌31-1菌株產細菌素研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2004.

[11] DELGADO A, BRITO D, FEVEREIRO P, et al. Bioactivity quantification of crude bacteriocin solutions[J]. Microbiological Methods, 2005, 2: 121-124.

[12] 劉國榮, 周康, 李平蘭, 等. 傳統干酪中一株產Ⅱa類細菌素乳酸菌的分離與鑒定[J]. 食品科學, 2007, 28(5): 185-190.

[13] 暢曉淵. 抗豬鏈球菌產細菌素乳酸菌的篩選及發酵工藝研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2010.

[14] 陳琳, 孟祥晨. 響應面法優化植物乳桿菌代謝產細菌素的發酵條件[J]. 食品科學, 2011, 32(3): 176-180.

[15] 呂燕妮, 李平蘭, 周偉. 戊糖乳桿菌31-1菌株產細菌素發酵條件的優化[J]. 微生物學通報, 2005, 32(3): 13-19.

[16] MOTTA A S, BRANDELLI A. Influence of growth conditions on bacteriocin production by Brevibacterium linens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 62(2/3): 163-167.

[17] LEROY F, VANKRUNKELSVEN S, de GREEF J. The stimulating effect of a harsh environment on the bacterioc inactivity by Enterococcus faecium RZS C5 and dependency on the environmental stress factor used[J]. Food Microbiology, 2003, 83(1): 27-38.

[18] 石金舟, 陳麗園, 陳曉林, 等. 細菌素發酵條件的研究[J]. 中國微生態學雜志, 2005, 17(5): 390-391.

Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production from Bif i dobacterium animal B04 by Response Surface Methodology

LIU Guo-rong1，ZHANG Jun-ying1，WANG Cheng-tao1，LI Ping-lan2,*，REN Li1
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The fermentation conditions for bacteriocin production from Bifidobacterium animal B04 isolated from centenarians’ intestine were optimized. The bacteriocin inhibitory activity (AU/mL) was used as evaluation index and quantified against L. monocytogenes ATCC 35152. Firstly, the effects of single factors including inoculum amount, initial pH, fermentation temperature and fermentation time on bacteriocin production from strain B04 were explored. Based on these single factor tests, response surface methodology with three variables such as initial pH, fermentation temperature and fermentation time was employed to optimize the fermentation conditions for bacteriocin production. Results showed the optimal fermentation conditions were inoculum amount of 1%, initial pH of 6.3, fermentation time of 29 h and fermentation temperature of 36 ℃. Under these optimal conditions, the bacteriocin inhibitory activity was increased by 2.37 fold and reached up to 3479.25 AU/mL. Finally, the consistent results between the predicted value and actual value indicated the established model in this study is feasible.

response surface methodology；bacteriocin；Bif i dobacterium animal；fermentation condition

TQ920.6

A

1002-6630(2013)03-0147-06

2012-09-14

國家自然科學基金項目(31201407)；北京市自然科學基金項目(5133034)；學科與研究生教育-食品學科特色教學科研創新平臺建設項目(PXM2012-014213-000063)

劉國榮(1983—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為乳酸菌及其活性代謝產物的理論與應用。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn