多奈哌齊對側腦室注射鏈脲菌素致癡呆大鼠的治療作用

申東方 張麗偉 宋榮蓉

多奈哌齊對側腦室注射鏈脲菌素致癡呆大鼠的治療作用

申東方 張麗偉 宋榮蓉

目的研究多奈哌齊對腦室注射鏈脲菌素（STZ）致癡呆大鼠的治療作用。方法健康SD雄性大鼠24只，隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊治療組，每組8只。模型組和治療組在手術的第1天和第3天分別向兩側側腦室內注射STZ 3 mg/kg，對照組給予相同體積的檸檬酸緩沖液。多奈哌齊治療組于手術前10 d給予多奈哌齊0.45mg/（kg·d）灌胃，術后持續8周，其余2組給予等量生理鹽水。術后第10天、第8周行Morris水迷宮試驗，觀察大鼠學習記憶能力。術后8周處死大鼠取海馬送電鏡觀察神經元凋亡情況。結果術后10 d水迷宮測試，與對照組比較，模型組與治療組的潛伏期延長，過平臺次數下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。術后治療8周，與模型組比較，治療組的潛伏期縮短，過平臺次數增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。電鏡下觀察多奈哌齊治療組大鼠海馬細胞結構細胞凋亡程度輕。結論側腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型穩定性高，多奈哌齊通過減輕AD模型鼠海馬神經元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用。

阿爾茨海默病；鏈脲菌素；多奈哌齊；神經元凋亡

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年人常見的神經系統變性病，是癡呆最常見的原因。其發病機制至今仍不十分清楚。腦內乙酰膽堿水平的降低可能是AD發生的機制之一［1］，抗膽堿酯酶藥物多奈哌齊用于治療AD病人，已被證明有效。鏈脲菌素（STZ）是一種烷基化物，大鼠腦室內小劑量注射STZ可被作為散發性AD的模型應用［2?3］。大量的臨床研究表明，神經細胞凋亡參與AD的發生。本實驗通過腦室注射STZ制作大鼠AD模型并應用多奈哌齊進行干預治療，以探討多奈哌齊對AD臨床癥狀的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠24只，2.5～3月齡，體質量200～250 g。由北京通利華實驗動物技術有限公司提供。大鼠隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊治療組，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器設備 多奈哌齊（法國PFIZEK· PGM公司），STZ（美國sigma公司），10％水合氯醛，枸櫞酸鈉溶液（武漢博士德生物工程有限公司），Morris水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所），大鼠立體定位儀（江西醫療器械研究所）。

1.3 模型制作方法

1.3.1 動物的篩選與分組：在實驗前先將動物進行水迷宮初篩，測量大鼠對水迷宮學習與記憶的獲取能力。按照Morris方法實驗分為兩部分：（1）定位航行實驗：共歷時5 d，每天上、下午各訓練1次。訓練時隨機選取一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺所需的時間（即潛伏期），每次訓練時間為60 s。如果大鼠在60 s內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期記為60 s，每次訓練后讓其在平臺上停留15 s。（2）空間搜索實驗：在第6天撤除水下平臺，隨機選取一個入水點，在同一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在60 s內跨過原平臺相應位置的次數和第1次通過平臺的時間。通過初篩，去除先天癡呆（潛伏期平均值＞50 s）和游泳姿勢不良者，將24只合格大鼠隨機分為對照組、模型組和多奈哌齊治療組，每組各8只。

1.3.2 動物模型的制作：水迷宮測試后48 h，SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，參考《大鼠腦立體定向圖譜Ⅲ》［4］，將大鼠的頭固定于立體定位儀上，剪去局部毛發，消毒后沿矢狀線切開皮膚，切口長約1.5 cm，將骨膜向兩側推開暴露顱骨，在前囟后1.5 mm、矢狀縫側方1.5 mm處鉆孔，微量進樣器垂直進入，深度距離腦表面3.5 mm，將STZ緩慢注入模型組及多奈哌齊治療組大鼠。STZ溶于檸檬酸緩沖液中（pH 4.4），在手術的第1天和第3天分別向兩側側腦室內注射，每次每側注入約10μl（3 mg/kg）左右。對照組大鼠給予相同體積的檸檬酸緩沖液腦室內注射。每側注入時間為5 min，留針5 min，緩慢出針。無菌骨蠟封閉鉆孔，術區滴慶大霉素，縫合消毒。術后大鼠除給予普通飼料及自來水喂養外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注每日1次共5 d以防止感染。

1.3.3 各組大鼠的處置：多奈哌齊治療組大鼠于手術前給予多奈哌齊0.45 mg/（kg·d）灌胃10 d，于側腦室注射STZ術后再持續多奈哌齊灌胃治療8周。對照組大鼠于手術前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側腦室注射與治療組等量檸檬酸平衡液，術后再持續生理鹽水灌胃8周。模型組大鼠于手術前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側腦室注射STZ后再持續生理鹽水灌胃8周。

1.3.4 大鼠學習記憶能力觀察：分別于術后第10天、第8周進行水迷宮試驗，觀察大鼠學習記憶能力。

1.3.5 海馬神經元凋亡檢測：術后第8周處死大鼠取腦海馬部位，送電鏡下觀察神經元凋亡情況。電鏡用固定液（本校電鏡室提供）固定過夜，PBS漂洗，丙酮脫水，1％四氧鋨酸后固定，環氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。PBS漂洗2次，2.5％的戊二醛固定后送哈爾濱醫科大學電鏡室觀察。

1.4 統計學處理 采用SAS統計軟件包對數據進行處理。所有數據均以±s表示，各組間數據進行方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦室內注射STZ后大鼠的一般情況 注射STZ后所有動物的體質量均較術前減輕，毛色發暗，不整齊，趨避力減弱。個別動物出現躁狂、抽搐等情況。術后48 h存活的大鼠絕大多數恢復正常。

2.2 各組大鼠學習記憶能力的變化 術前對照組、模型組、多奈哌齊治療組的潛伏期、過平臺次數無顯著性差異（P＞0.05）。術后第10天，模型組、多奈哌齊治療組潛伏期較對照組明顯延長（P＜0.01）。過平臺次數與對照組比較顯著減少（P＜0.01）。術后給予藥物治療8周，多奈哌齊治療組的潛伏期與模型組比較，顯著縮短（P＜0.01），過平臺次數顯著增多（P＜0.01）。見表1，2。

表1 不同時期大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期（±s，s，n＝8）

表1 不同時期大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期（±s，s，n＝8）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 術前 術后第10天 術后第8周對照組 17.37±9.10 16.30±5.35 17.08±7.31模型組 18.63±7.93 50.25±3.21??49.65±6.81治療組 18.18±7.93 48.60±8.21??26.10±9.50△△

表2 3組大鼠過平臺次數比較（±s，n＝8）

表2 3組大鼠過平臺次數比較（±s，n＝8）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 術前 術后第10天 術后第8周對照組 3.10±1.52 2.74±1.21 3.10±1.63模型組 3.20±0.99 0.70±0.32?? 0.96±0.20治療組 2.90±1.13 0.75±0.38?? 3.01±1.38△△

2.3 細胞學改變 模型組海馬細胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體嵴斷裂或空泡變，核周板層體崩解形成髓樣變，其他細胞器消失。多奈哌齊治療組表面微絨毛豐富，細胞器結構和膜結構完好，胞質、核周板層體豐富，結構完整（圖1）。

圖1 模型組與治療組海馬細胞學改變（×2550）

3 討論

AD是一種主要在老年期發生的以進行性智能衰退為主要特征的神經元退變性疾病，主要表現為持續進行性認知功能障礙而無緩解、記憶力衰退、性格和行為改變等。其病理特征為老年斑、神經元纖維纏結、海馬錐體細胞空泡變性及神經元缺失。AD病因迄今不明。大量研究表明，腦內神經遞質受體在AD發病中起著重要的作用［5］。隨著神經元的缺失，各種神經遞質也隨之缺乏，其中最早也最明顯的是乙酰膽堿。膽堿能受體除與大腦的學習和記憶功能有關外，還具有明顯的神經保護作用［6］。隨著疾病逐步發展，AD患者腦內乙酰膽堿水平迅速下降。但其降低的原因還未完全闡明。由于大量的神經元凋亡，導致大腦皮層出現萎縮。大體病理可見腦溝變寬，腦回變窄，腦室擴大。鏡下可見老年斑、神經元纖維纏結和神經元減少等主要病理學特征。

多奈哌齊是一種具有高度選擇性、可逆性的膽堿酯酶抑制劑，通過抑制膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解并提高活性，改善神經遞質的傳遞功能。大量研究顯示，多奈哌齊能改善AD病人的膽堿能系統功能，提高認知能力［7］。

在人體進行AD研究有很多局限性，因此，建立可靠穩定的動物模型具有重要意義。STZ對機體組織毒性相對較小，動物存活率高，是目前國內外使用較多的制備糖尿病動物模型的方法。小劑量STZ側腦室注射可以制備癡呆模型，卻未使模型產生糖尿病。原因是側腦室注射，使藥物不能通過血腦屏障，不能對胰腺產生毒性作用，卻可以對腦內胰島素受體產生破壞作用，影響腦的能量代謝，引起神經元的破壞，從而引起癡呆。并未引起外周血糖的任何變化，說明其致癡呆性與血糖無關，但可引起大腦持久的葡萄糖和能量代謝障礙，不但使海馬膽堿乙酰轉移酶水平降低，還引起動物學習和記憶能力損傷。這個模型與人患AD的病理及臨床特征相似，既出現認知功能的進行性惡化，也有腦葡萄糖和能量代謝功能的障礙［8］。

本實驗結果顯示，側腦室注射STZ術后10 d，對大鼠進行Morris水迷宮測試，模型組與多奈哌齊治療組的潛伏期與對照組比較明顯延長，過平臺次數明顯下降，表明STZ側腦室注射10 d后，大鼠的認知功能明顯下降。側腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型可靠性好，穩定性高，與先前文獻報道結果一致［3，9］。

術后給予多奈哌齊治療8周，對大鼠進行Morris水迷宮測試，與模型組比較，多奈哌齊治療組的潛伏期明顯縮短，過平臺次數明顯增加，表明多奈哌齊治療改善大鼠認知功能。

電鏡下觀察大鼠海馬細胞結構，模型組海馬細胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體嵴斷裂或空泡變，核周板層體崩解形成髓樣變，其他細胞器消失。多奈哌齊治療組表面微絨毛豐富，細胞器結構和膜結構完好，胞質、核周板層體豐富，結構完整。表明多奈哌齊通過減輕AD模型鼠海馬神經元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用。

［1］ Victor M，Ropper AH.Degenerative diseases of the nervous system.In：Victor M，Ropper AH.Adams and Victor's principles of neurology［M］.7thedition.Mc Graw?Hill Inc，2001：1106?1174.

［2］ Plaschke K，Hoyer S.Action of the diabetogenic drug strep?tozotocin on glycolytic and glycogenolyticmetabolism in adult rat brain cortex and hippocampus［J］.Int JDev Neurosci，1993，11（4）：477?483.

［3］ Lannert H，Hoyer S.Intracerebroventricular administration of streptozotocin causes long?term diminutions in learning and memory abilities and in cerebral energy metabolism in adult rats［J］.Behav Neurosci，1998，112（5）：1199?1208.

［4］ 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜（Ⅲ）［M］.北京：人民出版社，1991：12?18.

［5］ Chauhan NB.Membrane dynamics，cholesterol homeostasis，and Alzheimer's disease［J］.JLipid Res，2003，44（11）：2019?2029.

［6］ Dajas?Bailador F，Wonnacott S.Nicotinic acetylcholine re?ceptors and the regulation of neuronal signalling［J］.Trends陽性、切緣陽性、大病灶、老年、累及宮頸腺體等［6］。因此對年齡較大，HPV持續陽性及有子宮肌瘤等合并癥患者應行子宮全切術。

［參考文獻］

［1］ Song SH，Lee JK，Oh MJ，etal.Persistent HPV infection af?terconization in patients with negative margins［J］.Gynecol Oncol，2006，101（3）：418?422.

［2］ Kim YT，Lee JM，Hur SY，et al.Clearance of human papil?lomavirus infection after successful conization in patients with cervical intraepithelial neoplasia［J］.Int J Cance，2010，126（8）：1903?1909.

［3］ Boulanger JC，Gondry J，Verhoest P，etal.Treatmentof CIN aftermenopa?use［J］.Eur JObstet?Gynecol Reprod Biol，2001，95（2）：175?180.

［4］ 蘭嵐，黃冬梅，鄧克紅，等.高級別宮頸上皮內瘤變的臨床診治分析［J］.實用婦產科雜志，2013，29（2）：140?144.

［5］ Lu CH，Liu FS，Kuo CJ，et al.Prediction of persistence or recurrence after conization for cervical intraepithelial neopla?siaⅢ［J］.Obstet Gynecol，2006，107（4）：830?835.

［6］ Moss EL，Dhar KK，Byrom J et al.The diagnostic accuracy of colposcopy in previously treated cervical intraepithelialne?oplasia［J］.JLow Genit Tract Dis，2009，13（1）：5?9.Pharmacol Sci，2004，25（6）：317?324.

［7］ 楊亞丹，蔣與剛.老年癡呆癥營養干預的研究進展［J］.實用老年醫學，2010，24（3）：248?250.

［8］ Lester?Coll N，Rivera EJ，Soscia SJ，et al.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes： Relevance to sporadic Alzheimer's disease［J］.JAlzheimer's Dis，2006，9（1）：13?33.

［9］ 于方，拓西平，呂建勇.側腦室注射β?淀粉樣蛋白制作阿爾茨海默病樣大鼠模型［J］.實用老年醫學，2010，24（6）：475?478.

（收稿日期：2013?05?14）

Effects of donepezil on ratsw ith A lzheimer's disease induced by intracerebroventricular injection of streptozotocin

SHEN Dong?fang，ZHANG Li?wei，SONG Rong?rong.Department ofNeurology，the Fourth Affiliated Hospital ofHaerbin Medical University，Haerbin 150001，China

Objective To investigate the effects of donepezil on rats with Alzheimer's disease（AD）induced by in?tracerebroventricular injection of streptozotocin. M ethods Twenty?four healthy SD rats were random ly divided into con?trol group，model group and donepezil treatment group（n＝8）.Donepezil treatment group received treatment of donepezil gavage（0.45 mg/kg·d））for10 days before surgery，and the treatmentwas continued for 8 weeks postoperatively.Mean?while，control group and model group received the same volume of saline.During the surgery，the streptozotocin dissolved in 0.9％Na citrate buffer was injected into both of the lateral cerebral ventricles（3 mg/kg）on the first and third day re?spectively in themodel group and treatmentgroup，and the same volume of citric acid bufferwas injected into cerebral ven?tricles in the control group.Each group was tested by Morrismaze to exam the abilities of learning and memory ability on the 10th day and 8 weeks after the operation，respectively.The neurological apoptotic status of hippocampus were studied by electron microscope 8 weeks after the operation. Results The latency of Morris maze was prolonged significantly（P＜0.01）and the time of passing through the platform was decreased significantly（P＜0.01）on the 10th day after the operation in both model and treatment group compared with control group.Eightweeks after the operation，the latency was decreased significantly（P＜0.01），the times increased significantly（P＜0.01），and the neurological apoptotic status of hippocampuswere less severe in treatment group compared withmodel group. Conclusions The ratmodel with AD in?duced by intracerebroventricular injection of Streptozotocin is stable.Donepezil could improve the learning and memory ability of ratswith AD，through alleviating the neurological apoptosis of hippocampus.

Alzheimer's disease；streptozotocin；donepezil；neurological apoptosis

R 749.16

A

10.3969/j.issn.1003?9198.2013.12.010

2013?07?25）

黑龍江省自然科學基金資助項目（0200869）

150001 黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科

宋榮蓉，Email：songrongrong12＠163.com