新生大鼠缺氧缺血后海馬區細胞凋亡及腦紅蛋白表達的實驗研究

劉新建

中國石油中心醫院兒科，河北廊坊 065000

新生兒缺氧缺血性腦損傷 （hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）后病死率高，并可產生永久性神經功能障礙，給家庭和社會都帶來沉重的負擔。HIBD的發病機制十分復雜，一直是臨床治療上棘手的問題，目前尚缺乏一種針對性強的神經元保護藥物。腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)具有明顯的保護神經元的功能，是新型內源性神經保護因子，其神經元保護機制將為神經系統疾病的治療研究提供了新的思路[1-2]。該研究選取新生大鼠HIBD模型對HIBD后不同時間點海馬CA1區腦紅蛋白(Ngb)的變化規律進行探討，對Ngb在HIBD病理形成過程中的作用機制進行闡述，為今后HIBD的治療另辟新徑。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取新生7日齡Wistar大鼠，河北醫科大學動物實驗中心提供，雌雄不限共 60只,體重 12～18g。

1.2 實驗儀器及試劑

石蠟切片機、Olympus光學顯微鏡、捷達JEDA801D形態學圖象分析系統、兔抗鼠Ngb多克隆抗體、DAB顯色劑、SP法免疫組織化學試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理 60只新生大鼠隨機分為sham組（6只）、正常對照組（6只）、HIBD組（48只）。正常對照組：均不進行任何處理，與sham組在相同時間斷頭取腦。sham組：行頸部手術，只暴露左側頸總動脈。HIBD組：參照Rice和吳婉芳等的方法，建立大鼠缺氧缺血性腦損傷模型。分別于HIBD后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d和14 d時間點將動物處死取材，依據時間點不同分成8個亞組，每組6只。

1.3.3 Ngb表達檢測 應用SP法免疫組織化學染色方法檢測各組海馬CA1區Ngb的表達，嚴格按照試劑盒說明書。結果判斷：以神經元胞漿出現棕黃色顆粒或胞漿胞核均為陽性信號。

1.4 統計方法

采用SAS9.0軟件進行分析。Ngb表達陽性細胞數以Means±SD表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

相對于sham組和正常對照組中，HIBD組Ngb陽性細胞數在缺血缺氧后3 h開始下降，6 h、12 h、24 h呈逐漸下降趨勢(P<0.05)。7 d時與sham組和正常對照比較，差異無統計學意義 (P＞0.05)，14 d時Ngb陽性細胞數基本上恢復sham組和正常對照組的水平。見表1。

表1 各組新生大鼠海馬CA1區Ngb表達比較(n/mm2)

3 討論

Ngb是近期發現的繼血紅蛋白和肌紅蛋白之后的第三種攜氧球蛋白，在中樞神經系統主要分布于大腦皮層第I～VI層以及海馬各區。目前，Ngb因其與氧具有高度親和力以及在神經組織的特異高表達而倍受矚目，尤其是一系列體內、外實驗研究表明[3]Ngb在腦內不同區域的表達程度與該區域對缺血、缺氧的敏感程度呈負相關，這給臨床治療缺氧缺血性腦病及其它一些神經元退行性疾病帶來了一線曙光。

在Ngb與腦缺氧缺血性損傷的研究中，Greenberg和Wang X等[4]研究結果證明缺血、缺氧可誘導Ngb表達，減輕腦損傷。國內張興毅等[5-6]研究結果也表明Ngb參與了缺氧狀態的腦神經元的保護。王航雁等[7-8]研究發現，宮內窘迫新生兒以及早產兒的血清Ngb表達水平明顯高于正常健康患兒，同時HIBD急性期患兒的血清Ngb含量明顯高于正常健康患兒，且病情越重，血清Ngb的含量越高，提示腦組織的缺氧缺血性損傷可能導致Ngb的升高。 目前關于Ngb在新生兒缺氧缺血性腦損傷后腦組織中的表達規律及作用的報道尚少。該研究結果顯示Ngb蛋白陽性細胞在缺血缺氧腦損傷制模恢復供氧后呈現時相性變化。

綜上所述，Ngb作為一種新型內源性神經保護因子[9]，可設想利用Ngb作為抗缺氧性腦損傷的保護劑對于降低神經系統后遺癥的發生率，提高患兒存活率及健康水平，具有廣泛的臨床應用前景。

[1]M Greenberg DA,Jin KY,Khan AA,et al.Neuroglobin:an endogenous neuroprotectant[J].Curropin Pharmcol,2008,8(1):20-24.

[2]林欣，李敏，胡亞卓，等.顱腦創傷后大鼠腦組織腦紅蛋白表達變化及其與神經元凋亡的關系研究[J].中國應用生理學雜志，2010,26(1):39-44.

[3]Hundahl CA,Allen GC,Nyengaard JR,et al.Neuroglobin in the rat brain:localization[J].Neuroendocrinology,2008,88(3):173-182.

[4]Greenberg D A，Jin K，Khan A A， et al.Neuroglobin:An endogenous neuroprotectant[J].Current Opinion in Pharmacology，2008，8(1):20－24.

[5]張興毅，陳長林，李慧仙.大鼠全腦缺血再灌注后腦紅蛋白的表達[J].實用心腦肺血管病雜志，2010，18(2):103-105.

[6]張興毅，陳長林，李慧仙，等.腦紅蛋白與caspase-3在大鼠海馬CA1區的相關性[J].山東醫藥，2010,40(1):40-41.

[7]王航雁，王靜，王萍，等.腦紅蛋白在新生兒血清中的表達及臨床意義[J].中華圍產醫學雜志，2007,10(2):121-122.

[8]王靜，王航雁，王萍，等.宮內窘迫新生兒血清腦紅蛋白的變化[J].實用兒科臨床雜志，2009,24(2):104-105.

[9]LiW,Wu Y,Ren C,et al.The activity of recombinant human neuroglobin as an antioxidant and free radical scavenger[J].Proteins,2011,79(1):115-25.