脫細胞真皮基質預制人工皮瓣的血管化研究

周顯玉 劉 菲 顧 釧 羅旭松 汪 希 楊 群 楊 軍

脫細胞真皮基質預制人工皮瓣的血管化研究

周顯玉 劉 菲 顧 釧 羅旭松 汪 希 楊 群 楊 軍

目的ADM聯合自體表皮構建人工皮瓣模型，探討人工皮瓣血管化所需時間。方法利用F344雄性大鼠構建人工皮瓣模型，分別在術后第3、7、14、21和28天取材，HE染色、CD31+免疫組化進行血管化檢測，術后7 d進行大鼠人工皮瓣模型微血管造影。結果術后各時間點人工皮瓣均成活良好，無感染或壞死；HE染色及CD31+免疫組化顯示，血管樣結構數量隨術后時間的延長而逐漸增多，除第21、28天血管數量無顯著性差異外（P＞0.05），其余各時間點之間血管數量均有顯著性差異（P＜0.05）；微血管造影顯示，去除ADM的人工皮瓣血管數量明顯少于ADM去除前。結論脫細胞真皮基質聯合帶知名血管的筋膜、自體表皮可以成功預制人工皮瓣。術后第3天人工皮瓣開始出現血管化跡象，第7天左右與筋膜組織建立相對可靠的血運，第21天左右基本完成血管化過程。

脫細胞真皮基質血管化自體表皮

創面修復是整復外科的重要問題，對于創基血供差或伴有重要神經、血管、骨外露的深度創面，移植的皮片無法成活，需采用各類皮瓣予以修復。但是，對于某些大面積燒傷、全身幾乎已無皮瓣供區的患者，創面的覆蓋成為難題[1]。為解決皮瓣供區來源短缺的問題，近年來利用復合皮膚移植，即真皮替代物與自體皮片復合移植覆蓋深部組織缺損暴露的創面，取得了較好的臨床效果[2]。

但是，由于真皮替代物在本質上屬于膠原組織，缺乏血供，移植到較深的創面或血供缺乏部位，較難獲得良好血供，使得臨床應用受到較大限制。因此，我們構建脫細胞真皮基質（Acellular dermal matrix，ADM）聯合自體表皮人工皮瓣模型，研究人工皮瓣血管化所需的時間，為今后的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

23只F344雄性大鼠（本院動物實驗中心），體質量（250±20）g。10 cm×12 cm J1型網狀脫細胞真皮基質（北京桀亞萊福生物技術有限責任公司）；CD31+羊抗鼠一抗（Abcam公司）；兔抗羊二抗（Dako公司）；DAB顯色液（Dako公司）；BaSO4粉末（Sigma公司）。ECLIPSE 90i顯微鏡（Nikon公司），石蠟切片機（Thermo公司），X線機（美國Carestream公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建ADM聯合自體表皮人工皮瓣模型

大鼠吸入性氣體全身麻醉。右側腹股溝區設計2.5 cm×4.0 cm的術區，沿設計線切開皮膚組織至筋膜層，離斷形成游離皮片，生理鹽水紗布保存。同時，切取同樣面積大小的ADM材料，覆蓋于暴露的筋膜組織創面上，4-0絲線間斷縫合固定。將全厚皮片修薄，去除真皮組織，剩下的大張表皮組織回植于ADM上，4-0絲線間斷縫合，敷料加壓包扎（圖1）。

圖1ADM聯合自體表皮預制人工皮瓣模型Fig.1Artificial skin flap model fabricated with ADM and autologous epidermis

1.2.2 人工皮瓣的大體觀察

隨機選擇人工皮瓣模型大鼠2只，在術后各時間點分別觀察人工皮瓣的成活及毛發生長情況。

1.2.3 HE染色及CD31+免疫組化檢測

人工皮瓣模型分別在術后第3、7、14、21和28天取材，5組各4只大鼠，取材時切至ADM下的筋膜層。石蠟切片，HE染色，CD31+免疫組化檢測血管內皮細胞，其中免疫組化一抗試劑濃度為1∶200，熱修復法暴露血管內皮細胞上的特異性抗原。每組含不同切片4張，鏡下觀察10個不同視野，分別計數血管樣結構，采用SPSS19.0軟件分析數據，數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。

1.2.4 人工皮瓣微血管造影

大體結果表明，人工皮瓣模型成功建立的最快時間是術后第7天。選擇大鼠1只，根據上述方法構建ADM聯合自體表皮人工皮瓣模型，術后第7天行人工皮瓣微血管造影。吸入性氣體全身麻醉，應用改良的大鼠腹主動脈插管造影技術，經下腹部橫行切口開腹，暴露腹主動脈及下腔靜脈，動脈夾夾閉腹主動脈，22號靜脈留置針插管，同時下腔靜脈近端結扎，遠端24號靜脈留置針造瘺引流，穿刺成功后松開動脈夾，30%BaSO4溶液主動脈插管灌注，保持每分鐘注射1 mL BaSO4溶液，直至大鼠死亡[3]。大鼠尸體4℃冰箱過夜后，沿腹股溝區游離包括相應的腹壁淺血管在內的右側腹股溝筋膜瓣，X線攝片。

2 結果

2.1 人工皮瓣的大體形態評估

術后第3天清晰可見表皮組織下白色的ADM材料；第7天表皮組織血運豐富，充血，創緣見死痂；第14天創緣死痂脫落，表皮充血逐漸消退，皮膚顏色趨于正常；第21天人工皮瓣表面光滑，血運佳，形態好；第28天創面完全愈合，顏色正常，皮瓣存活好。術后各時間點創面無明顯破潰、感染或ADM暴露，第21至第28天創面見明顯毛發生長（圖2）。

圖2 人工皮瓣術后各時間點大體觀Fig.2 Gross observation of artificial skin flap at each time postoperatively

2.2 人工皮瓣毛細血管密度評估

第3、7及14天ADM位于表皮層與筋膜層之間，界限明顯，表皮層逐漸由厚變薄，細胞形態、數量及排列由紊亂逐漸趨于正常，ADM層膠原排列由整齊有序到局部分解，出現裂隙，排列不規則、紊亂。第3天見多量血管穿過ADM網孔向上垂直長入，ADM膠原內炎性細胞浸潤在第7天達到高峰。ADM材料周圍血管逐漸增多，并可見少量微血管結構長入ADM膠原內。第21和28天ADM與表皮層、筋膜組織層界限模糊，表皮細胞層進一步變薄，ADM層膠原組織結構紊亂，裂隙明顯，局部可見毛囊生成，血管數量明顯增多（圖3）。

HE染色血管計數顯示，血管樣結構數量逐漸增多，第7天開始顯著增加。第21和28天無顯著性差異（P＞0.05），其余均差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4HE染色術后各時間點血管樣結構數量Fig.4Capillary density at each time postoperatively by HE staining

2.3 人工皮瓣毛細血管密度的CD31+免疫組化

CD31+免疫組化染色顯示，血管樣結構數量隨術后時間延長而逐漸增多，伴有炎性細胞浸潤（圖5）。

血管計數發現，血管樣結構數量逐漸增多，術后第7天顯著增加，第21和28天血管計數無顯著性差異外（P＞0.05），其余均有顯著性差異（P＜0.05）（圖6）。

2.4 人工皮瓣的微血管造影觀察

術后第7天大鼠30%BaSO4溶液活體腹主動脈灌注，見下腔靜脈造瘺留置管回流的BaSO4溶液和股血管及其分支。體外游離的人工皮瓣見表皮下ADM組織和充斥BaSO4溶液的白色股血管及腹壁淺血管，X線攝片見其腹壁淺血管及其豐富的分支，去除表皮下的ADM材料后再行X線造影，見人工皮瓣的血管數量明顯減少（圖7）。

圖5 人工皮瓣毛細血管密度CD31+免疫組化鏡下觀察（200×）Fig.5 Capillary density of artificial skin by CD31+immunohistochemistry(200×)

圖6 CD31+免疫組化染色各時間點血管樣結構數量Fig.6 Capillary density at each time postoperatively by CD31+immunohistochemistry

圖7 術后第7天大鼠BaSO4溶液活體灌注及游離人工皮瓣體外X線攝片Fig.7 BaSO4solution perfusion of rat 7 days after operation in vivo and X-ray microangiography of isolated artificial skin flap

3 討論

復雜創面修復是整復外科的難題。根據創面的大小及深度，可選用皮片移植、皮瓣轉移及帶蒂游離移植等方法進行修復[4]。Shen[5]提出，在缺乏合適供區皮瓣以供轉移時，可在皮下埋置血管蒂“預構”皮瓣，修復創面；在此基礎上，提出的“預制”皮瓣的方法，擴大了皮瓣的制作及應用范圍[6]。

單純真皮替代物修復缺損時，創基血管建立血供的時間因缺損部位及大小、缺損程度、受區創基血運及真皮替代物的材質等而不同，一般移植后第3天即有血管化跡象，4周后真皮替代物多能被肉芽組織取代，新生血管基本穩定[7-10]。然而，真皮替代物作為異體組織存在創基血管延遲或難以長入的缺陷。因此，可在進行真皮替代物覆蓋創面或預制皮瓣的同時，移植各種干細胞[11-12]或細胞因子[13-21]，以促進真皮替代物的血管化進程，提高皮瓣的成活率。

本實驗中，我們利用ADM聯合自體表皮預制人工皮瓣，關鍵在于筋膜瓣血管通過ADM的網孔，并與表皮建立良好血供。腹股溝區筋膜瓣血供由腹壁淺血管及其分支直接提供，我們將ADM真皮替代物材料直接埋置在筋膜上，同時回植修薄的大張表皮皮片，局部加壓，以促進筋膜瓣血管通過ADM網孔與表皮組織建立穩定血供，保證表皮皮片以及整個腹股溝區人工皮瓣的成活。實驗發現，術后第3天解除局部敷料的加壓作用后，表皮皮片逐漸壞死。因此，影響人工皮瓣成活的因素除ADM材質因素外[22]，還與局部加壓的時間長短相關。

此外，實驗中F344大鼠腹股溝區皮膚創面設計在總面積與長寬比例上，均大于公認的成年大鼠單側腹壁淺血管所支配的血供范圍，提示我們腹壁淺血管皮瓣在設計上可選用更大面積和比例，為后期干細胞或者細胞因子促進人工皮瓣血管化的研究，提供了易于顯示差異的模型設計思路及干預條件。

從實驗結果來看，利用ADM和自體表皮構建的人工皮瓣在預制7 d后即可形成營養表皮成活的新的血供系統。通過BaSO4溶液灌注X線攝片可以發現，由股血管發出的血管分支術后第7天在ADM組織中已經形成良好的血管網，該血管網的形成是表皮移植成活的重要條件。根據HE染色與CD31+免疫組化檢測結果可以判斷，人工皮瓣的血管生成隨著時間的延長而逐漸增多，直至第21天左右基本達到穩定狀態，之后血管生成速率減緩，表明預制的人工皮瓣在第21天能達到較為可靠的血供狀態。

本實驗將ADM組織與皮瓣預制的方法相結合，探索了人工皮瓣的預制模型及其血管化進程，為臨床上疑難創面的修復開辟了一條新的途徑。

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Vascularization of Artificial Skin Flap Fabricated by Acellular Dermal Matrix

ZHOU Xianyu,LIU Fei,GU Chuan,LUO Xusong,WANG Xi,YANG Qun,YANG Jun.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YANG Jun(E-mail:yj55569@hotmail.com).

ObjectiveTo fabricated the artificial skin flap by using acellular dermal matrix,vascularized fascia and autologous epidermis and to evaluate the time of vascularization in artificial skin flap.Methods Artificial skin flap models were established with Fisher 344 male rats.The artificial skin flaps were harvested for HE staining and CD31+immunohistochemistry on 3,7,14,21,28 days after operation respectively.Microangiography for artificial skin flap was carried out 7 days after operation,the shortest time to complete the process of model establishing.ResultsAll artificial skin flaps presented a good viability without any infection or necrosis in gross observation.Angiogenesis of HE staining and CD31+immunohistochemistry suggested that the total number of vessels increase when prolonging postoperative time and there is a significant difference between every two time intervals(P＜0.05)except between 21 and 28 days after operation(P＞0.05).Microangiography suggests less vessels after removing ADM.ConclusionArtificial skin flap could be successfully fabricated with ADM and autologous epidermis.The capillary vessels of composite skin flap begin to sprout 3 days after operation.Relatively reliable blood supply is basically established between epidermis and fascia on about 7 days after operation.Angiogenesis is completed on about 21 days after operation.

Acellular dermal matrix;Angiogenesis;Autologous epidermis

R622

A

1673－0364（2013）02－0072－04

2013年1月14日；

2013年3月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.003

上海市科學技術委員會科研計劃項目（課題編號：10411964200）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

楊軍（E-mial：yj55569@hotmail.com）。