構(gòu)建攜帶hTERT基因的慢病毒重組載體及其包裝和表達(dá)

馬 迪 嚴(yán)佶祺 彭承宏 施敏敏 傅文祎 王維杰 李宏為

構(gòu)建攜帶hTERT基因的慢病毒重組載體及其包裝和表達(dá)

馬 迪 嚴(yán)佶祺 彭承宏 施敏敏 傅文祎 王維杰 李宏為

目的構(gòu)建含hTERT基因的慢病毒重組載體，進(jìn)行病毒包裝并檢測(cè)hTERT在293T細(xì)胞中的表達(dá)。方法PCR擴(kuò)增hTERT，插入慢病毒載體，并與包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝，并測(cè)定其滴度。Western-Blot檢測(cè)慢病毒液感染293T細(xì)胞后hTERT的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建了含hTERT的慢病毒重組載體，滴度為2.79×107Tu/mL，Western-Blot檢測(cè)顯示慢病毒液感染的293T細(xì)胞中hTERT基因高表達(dá)。結(jié)論含hTERT的慢病毒重組載體成功構(gòu)建并包裝后能夠順利感染293T細(xì)胞，并陽(yáng)性表達(dá)目的基因。

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶慢病毒重組載體

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是存在于骨髓內(nèi)的一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，一定條件下可經(jīng)誘導(dǎo)定向分化為骨、軟骨、肌腱等細(xì)胞系。作為組織工程理想的種子細(xì)胞，BMSCs已成為研究熱點(diǎn)[1-2]，并展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景[3]。但是，BMSC與機(jī)體其他細(xì)胞一樣也具有Hayflick界限，隨著細(xì)胞的分裂增殖次數(shù)增多而伴隨出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，不僅會(huì)降低分裂能力，也會(huì)影響其多向分化潛能。

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）決定著端粒酶活性。研究表明，外源性表達(dá)hTERT可以提高細(xì)胞端粒酶活性，使其增殖分裂能力增強(qiáng)，并賦予細(xì)胞抗衰老甚至永生化的能力[4-5]。本實(shí)驗(yàn)嘗試構(gòu)建攜帶hTERT基因的重組慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行包裝、滴度測(cè)定和感染293T細(xì)胞后的鑒定，進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)改造BMSC，增加細(xì)胞的分裂增殖能力、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，為組織工程種子細(xì)胞的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

慢病毒表達(dá)載體3D-LV-OE-018EG及其包裝質(zhì)粒（上海思路迪生物技術(shù)有限公司）；包含hTERT全長(zhǎng)的質(zhì)粒GC-Q0450（廣州復(fù)能基因有限公司）；293T細(xì)胞（ATCC）；KOD-Plus（TOYOBO公司）；限制性內(nèi)切酶XbaI（寶生物工程有限公司）；限制性內(nèi)切酶BstBI（NEB公司）；Lipofectamine 2000（Life Technologies Corporation）；蛋白濃度測(cè)定試劑盒（PIERCE公司）；小鼠抗人FLAG一抗（SIGMA）；HRP標(biāo)記二抗（上?？党缮锕こ坦荆籶olybrene（SIGMA）；RIPA裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物有限公司）；濾紙（BIO-RAD公司）；PCR儀（BIO-RAD公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）；凝膠成像儀（Amersham Biosciences公司）；電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD公司）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含hTERT的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增

GenBank上查hTERT基因序列（NM_198253.2），設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 sec，56℃退火30 sec，68℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；68℃延伸9 min）。PRIMER F：ctagTCTAGAccgcgcgctccccgctg；PRIMER R：gccTTCGAAgtccaggatggtcttgaagtctgagggc。引物中TCTAGA及TTCGAA分別表示限制性內(nèi)切酶XbaI和BstBI序列。PCR體系為50 μL體系，含質(zhì)粒0.2 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Kod plus buffer 5 μL，Kod plus 1 μL。

1.2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及慢病毒載體的酶切回收、連接及鑒定

利用限制性內(nèi)切酶XbaI和BstBI對(duì)含hTERT的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及慢病毒載體（慢病毒載體的完整元件為EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP）進(jìn)行雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳獲得相應(yīng)目的條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行酶切產(chǎn)物膠純化回收。在T4DNA連接酶的作用下對(duì)含hTERT的目的片段以及慢病毒載體片段進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取LB培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌落，再次通過(guò)雙酶切及凝膠電泳鑒定是否正確，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為TERT/3D-LV-OE-018EG，并送華大基因檢測(cè)確定基因序列的正確性。

1.2.3 重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)佳的293T細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1天，進(jìn)行胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以10% FBS+DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量并接種于100 mm培養(yǎng)平皿中，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到3×106個(gè)/皿。將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒抽提后，制備質(zhì)粒DNA，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%~80%融合時(shí)進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將293T細(xì)胞上清換為無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)制備Lipofectamine 2000+無(wú)血清培養(yǎng)基的混合液和重組質(zhì)粒+無(wú)血清培養(yǎng)基混合物，各自室溫孵育5 min，小心混勻兩種混合物，室溫孵育20 min后緩慢加入培養(yǎng)皿中，使之與細(xì)胞混合均勻，8 h后換為含血清的完全培養(yǎng)基；48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，空病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.4 重組慢病毒的包裝及滴度測(cè)定

慢病毒質(zhì)粒DNA總量為12 μg（包含重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及包裝輔助質(zhì)粒3D LV Packaging Mix），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為24 μL，各以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋調(diào)整總體積為500 μL，室溫下孵育5 min?；旌弦陨蟽煞N液體，室溫孵育20 min，將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，充分混勻后放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染48 h及72 h后，分別收集293T細(xì)胞上清液。Millex-HV 0.45 μm濾膜過(guò)濾純化病毒上清液，4℃下20 000 r/min，超速離心2 h濃縮病毒，DMEM 200 μL重懸后，20 μL每EP管分裝，-80℃保存，留取其中一管以備滴度測(cè)定。

滴度測(cè)定前1天，常規(guī)胰酶消化293T細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105cells/mL，并接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔為100 μL。接種后第2天，留取數(shù)個(gè)無(wú)菌EP管，將病毒原液10 μL加入第1管內(nèi)，并加入90 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，充分混勻后吸取10 μL液體加入第2管內(nèi)，并同樣加入90 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，以此類推，倍比稀釋慢病毒濃縮液（各EP管內(nèi)病毒原液分別為10 μL、1 μL、10-1μL、10-2μL、10-3μL、10-4μL）。選取待測(cè)孔，各孔內(nèi)加入以上不同稀釋梯度的病毒液10 μL，加入polybrene并調(diào)整至終濃度為8 μg/mL，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，并計(jì)算病毒滴度[6-7]。

1.2.5 重組慢病毒液感染293T細(xì)胞及Western－Blot驗(yàn)證hTERT蛋白表達(dá)水平

取包裝后的重組慢病毒液感染293T細(xì)胞，感染48 h后收集細(xì)胞標(biāo)本，抽提細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，確定上樣體積，PCR儀內(nèi)100℃蛋白熱變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉及添加抗FLAG一抗及HRP標(biāo)記二抗，ECL法發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像，讀取并分析計(jì)算各個(gè)條帶的灰度值，重復(fù)3次，空載病毒液感染組作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建攜帶hTERT基因的慢病毒重組表達(dá)載體

通過(guò)限制性內(nèi)切酶XbaI及BstBI雙酶切，慢病毒重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后，成像、攝片，可得到2條高亮條帶，分別是慢病毒載體的線性化片段與hTERT目的基因片段（3.5 Kb）。同時(shí)將重組慢病毒質(zhì)粒送檢測(cè)序，結(jié)果提示插入片段與質(zhì)粒GC-Q0450中hTERT基因序列一致（圖1）。

圖1 慢病毒重組載體XbaI及BstBI雙酶切凝膠電泳鑒定Fig.1 Identification of recombinant vector by using restriction endonuclease XbaI and BstBI

2.2 重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，重組慢病毒組與空載病毒組均于熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建并成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（圖2）。

2.3 重組慢病毒液的滴度測(cè)定

熒光顯微鏡觀察顯示，熒光細(xì)胞數(shù)目隨著病毒液的稀釋倍數(shù)增加而逐步減少，按逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定其滴度為2.79×107Tu/mL。

2.4 重組慢病毒液感染293T細(xì)胞后hTERT蛋白水平的檢測(cè)

重組慢病毒液及空載慢病毒液感染293T細(xì)胞后，Western－Blot檢測(cè)顯示，重組慢病毒組有FLAG標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，而空載體組未見有FLAG標(biāo)簽蛋白的相關(guān)表達(dá)。由于目的基因hTERT已與FLAG標(biāo)簽蛋白融合，結(jié)果充分說(shuō)明經(jīng)包裝后的重組慢病毒液能夠成功感染293T細(xì)胞，并在293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)目的基因（圖3）。

圖2 重組慢病毒質(zhì)粒（A）及空載病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（B）熒光蛋白表達(dá)情況(100×)Fig.2 The fluorescence microscopy image of 293T cells transfected with recombinant plasmid(A)and 3D-LV-OE-018EG(B)(100×)

圖3 Western-Blot檢測(cè)空載病毒液與重組慢病毒液感染293T細(xì)胞后FLAG標(biāo)簽蛋白的表達(dá)Fig.3The expression of FLAG in 293T cells infected by recombinant virus supernatant and empty virus supernatant by Western-Blot

3 討論

選用合適的目的基因?qū)ΨN子細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其能克服生存界限，獲得更強(qiáng)大的分裂增殖能力，甚至進(jìn)一步成為永生化細(xì)胞株，是組織工程種子細(xì)胞研究中新的課題。有研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶作為一種核糖核蛋白復(fù)合體，在維持細(xì)胞壽命方面具有重要作用[8]，通過(guò)誘導(dǎo)端粒酶的產(chǎn)生可維持端粒的長(zhǎng)度，從而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。而端粒酶的活性主要由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）決定。本研究選用的目的基因hTERT，已被多項(xiàng)研究證明，其外源性的輸入可以提高端粒酶的活性并延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[9-10]。作為構(gòu)建永生化細(xì)胞系的常用方法之一，以SV40為首的病毒癌基因介導(dǎo)的永生細(xì)胞株的構(gòu)建過(guò)程中，可能存在成瘤隱患和病毒感染的危險(xiǎn)；hTERT介導(dǎo)的細(xì)胞永生化的安全性相對(duì)更高，致瘤風(fēng)險(xiǎn)更低。

選擇合適的載體將目的基因有效轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶細(xì)胞，并在靶細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、執(zhí)行相關(guān)作用，是基因治療中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。目前常見的載體大致可分為病毒類載體和非病毒類載體。由于轉(zhuǎn)染效率過(guò)低，非病毒類載體的應(yīng)用受到了限制，而病毒類載體中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體雖已具備了真核表達(dá)載體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但因無(wú)法感染非分裂期細(xì)胞[11]、容易誘發(fā)機(jī)體免疫毒性反應(yīng)和目的基因表達(dá)不穩(wěn)定[12]，使其應(yīng)用受到限制。考慮到基因治療的最終目的，本實(shí)驗(yàn)選用了改進(jìn)的慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)3D-LV-OE-018EG，相較于早期構(gòu)建的HIV-I型慢病毒載體，具有更高的安全性和有效性，對(duì)于后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中安全無(wú)成瘤危險(xiǎn)的要求提供了充分的保障。而慢病毒載體本身所具備的感染非分裂及終末分化細(xì)胞能力[13]、高轉(zhuǎn)染效率、可容納大片段外源目的基因等優(yōu)勢(shì)，也使其在各類原代細(xì)胞以及干細(xì)胞的研究應(yīng)用中展現(xiàn)出了不小的潛力。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)PCR方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并使其定向連接到目的載體上，結(jié)合酶切電泳以及測(cè)序鑒定結(jié)果，順利克隆了目的基因的編碼區(qū)序列，并利用慢病毒載體作為基因載體，成功構(gòu)建了含有目的基因的慢病毒表達(dá)載體TERT/3D-LVOE-018EG。經(jīng)過(guò)包裝后獲得了高滴度的重組慢病毒液，感染293T細(xì)胞后檢測(cè)到目的基因在蛋白水平的高表達(dá)，表明了重組慢病毒液不僅能在293T細(xì)胞中正常工作并且能夠表達(dá)目的基因蛋白，為今后的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]周栩,周廣東,張路,等.不同體外誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BMSCs成軟骨分化的組織學(xué)特性影響的研究[J].組織工程與重建外科,2011,7(2)：70-74.

[2]李佳濱,張文杰,崔福齋,等.P17-BMP2多肽促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科,2012,8 (2)：65-68.

[3]馬迪,嚴(yán)佶祺,張明鈞,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠小體積肝移植后肝再生的實(shí)驗(yàn)研究[J].肝膽外科雜志,2012,20(4)：301-303.

[4]Li NF,Broad S,Lu YJ,et a1.Human ovarian surface epithelial cells immortalized with hTERT maintain functional pRb and p53 expression[J].Cell Prolif,2007,40(5)：780-794.

[5]Yuan J,Yang BM,Zhong ZH,et a1.Up regulation of survivin duringimmortalizationofnontransformedhumanfibroblasts transduced with telomerase reverse transcriptase[J].Oncogene, 2009,28(29)：2678-2689.

[6]LaBarre DD,Lowy RJ.Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50 and plaque assays[J].J Virol Methods,2001,96(2)：107-126.

[7]Nauta JJ,de Brujin IA.On the bias in HIV titers and how to reduce it[J].Vaccine,2006,24(46)：6645-6646.

[8]Ju Z,Rudolph KL.Telomeres and telomerase in stem cells during aging and disease[J].Genome Dyn,2006,1：84-103.

[9]Hung CJ,Yao CL,Cheng FC,et al.Establishment of immortalized mesenchymal stromal cells with red fluorescence protein expression for in vivo transplantation and tracing in the rat model with traumatic brain injury[J].Cytothreapy,2010,12(4)：455-465.

[10]林若蕓,黎丹戎,鐘艷平,等.過(guò)表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2011,27(1)：84-89.

[11]Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference[J].Cancer Cell,2002,2(3)：243-247.

[12]馬曉生,姜建元,呂飛舟,等.腺病毒和慢病毒載體感染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的比較[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(47)：3340-3344.

[13]張艷,柴崗,劉偉,等.Cathepsin K基因慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建[J].組織工程與重建外科,2005,1(3)：165-166.

Construction of Recombinant Lentivirus Vector Carrying hTERT Gene and Its Packaging and Expression

MA Di,YAN Jiqi,PENG Chenghong,SHI Minmin,FU Wenwei,WANG Weijie,LI Hongwei.Department of Surgery,Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;Shanghai Institute of Digestive Surgery,Shanghai 200025,China.Corresponding author:YAN Jiqi(E-mail:yanjiqi@yahoo.com.cn);PENG Chenghong(E-mail:chhpeng@medmail.com).

ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector containing hTERT gene and detect the expression of hTERT in 293T cells.MethodsThe hTERT gene amplified by PCR was inserted into the lentivirus vector,the recombinant lentivirus vector was transfected into 293T cells with the packaging plasmids and the titre was determined.The expression of hTERT in 293T cells was determined by Western blot.ResultsThe result proved that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully and the titre of virus supernatant was 2.79×107Tu/mL.Western blot showed the positive expression of hTERT in 293T cells which were infected by recombinant virus supernatant.ConclusionThe recombinant lentivirus vector could be constructed and packaged successfully,the expression of hTERT gene was positive after the 293T cells were infected by recombinant virus supernatant.

Human telomerase reverse transcriptase;Lentivirus;Recombinant vector

Q786

A

1673－0364（2013）02－0085－04

2013年1月9日；

2013年2月18日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（81070358）；上海市自然科學(xué)基金（09ZR1418600）。

200025上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科；上海消化外科研究所。

嚴(yán)佶祺（E-mail：yanjiqi@yahoo.com.cn）；彭承宏（E-mail：chhpeng@medmail.com）。