H7N9禽流感病毒感染及其實驗室診斷

董曉毅，孫長貴

(解放軍117醫院檢驗科南京軍區醫學檢驗質量控制中心，浙江杭州310013)

·述評·

H7N9禽流感病毒感染及其實驗室診斷

董曉毅，孫長貴

(解放軍117醫院檢驗科南京軍區醫學檢驗質量控制中心，浙江杭州310013)

至2013年4月23日，新型H7N9亞型的禽流感病毒已經在中國感染了108人，并致22人死亡。科學家發現甲型禽流感病毒H7N9源自3種病毒株的重配，并出現了實質性的突變。H7N9病毒擁有幾個哺乳動物流感病毒的特征，從而形成了對人類的感染力，因此需重視其大規模流行的潛力。本文對該病毒的生物學特性、流行病學、臨床表現和實驗室診斷進行了簡要綜述。

H7N9；禽流感病毒；感染

中國國家衛生和計劃生育委員會于3月31日首次通報，上海市和安徽省發現3例人感染H7N9禽流感病例。H7N9禽流感是由新亞型H7N9禽流感病毒引起，該病毒是全球首次發現，因其是一種新亞型，起病急、進展快、致死率高，受到廣泛關注。目前對H7N9禽流感病毒的研究仍處于起步階段，本文對近期國內有關H7N9禽流感病毒的生物學特性、流行病學、臨床表現和實驗室診斷等方面的研究進展作簡要綜述。

1 H7N9禽流感病毒的生物學特性

H7N9是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的一個亞型，AIV屬于正黏病毒科(orthomyxoviridae)甲型流感病毒屬，是引起禽流行性感冒的病原體。AIV表面有釘狀的血細胞凝集素(hemagglutinin，HA)和蘑菇狀的神經氨酸酶(neuraminidase，NA)兩種糖蛋白，根據HA和NA的抗原性差異，可將AIV分為16個H亞型(H1～H16)和9個N亞型(N1～N9)。H7N9就是其中一種，在2013年以前，H7N9僅感染禽類，并未發現過感染人的情況[1]。

禽流感病毒普遍對熱敏感，對低溫抵抗力較強，65℃加熱30min或煮沸(100℃)2min以上可滅活。病毒在較低溫度糞便中可存活1周，在4℃水中可存活1個月，對酸性環境有一定抵抗力，在pH4.0的條件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情況下可保持活力1年以上[2]。

2 H7N9禽流感病毒的分子進化

AIV基因組由8個分節段單股負鏈RNA組成，編碼8種結構蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)和2種非結構蛋白(NS1和NS2)。有關新型H7N9病毒的起源、進化和感染途徑等大多數信息，均來自于對已發現的H7N9病毒基因組序列的分析、比對和推斷。

中國杭州疾病預防控制中心和WHO中國流感中心共采集和分析了4個新H7N9甲型禽流感病毒的基因組，并提交GISAID數據庫，分別為A/ Shanghai/1/2013、A/Shanghai/2/2013、A/Anhui/1/2013和A/Hongzhou/1/2013(數據不全，僅有HA、NA和M)，樣本均來源于人類患者[3-6]。

在核苷酸和氨基酸水平上，所有4個新H7N9甲型禽流感病毒的序列都高度相似，提示其來源

于同一個祖先。它們的HA基因屬于禽流感病毒的歐亞譜系，與1株2011年分離自浙江省鴨群的H7N3病毒的基因序列相似度最高，為95%。新病毒的NA基因則與1株2010年分離自捷克的野鴨的H11N9相似度最高，為96%，另外1株相似度最高的NA基因來源于韓國野鳥的H7N9病毒。其余6個基因則均與H9N2病毒基因高度相似(97%)[3-5]。H9N2亞型已在東亞地區循環了很多年，其跨種感染人的機制剛剛得到證實：H9N2亞型可感染人肺組織，主要的靶細胞為Ⅱ型肺泡細胞、呼吸細支氣管上皮細胞和細支氣管上皮細胞，并可在人肺上皮細胞中有效復制[7]。由此可以推斷，新型的H7N9病毒并非來源于舊有的H7N9病毒，而更可能是一種新型的三聯重配體，即由3種不同的禽流感病毒重配而成，而重配地點可能就在我國的東部長三角地區[4,5]。重配而成的H7N9擁有了感染人類的能力。

在核酸水平上，A/Shanghai/2/2013,A/Anhui/1/ 2013和A/Hangzhou/1/2013三者核苷酸序列高度相似(99%)，而A/Shanghai/1/2013與眾不同，它與A/Shanghai/2/2013的核苷酸序列相差達52個核苷酸，提示A/Shanghai/1/2013與其它新H7N9病毒來源不同[3-5]。

另外，HA受體結合位點的氨基酸序列決定了對人類或禽類的偏好性，對H7N9序列分析中發現的幾種突變，如A138S、Q226L、G186V等，都可增加H5、H7病毒與人類受體的結合能力。而位于150-loop的T160A突變，也可導致N-糖基化位點的缺失，最終造成病毒對人類受體結合能力的增加[5]。

在PB2蛋白627位的賴氨酸是禽流感病毒能在哺乳動物中有效復制的重要標志，曾在高致病性H5N1和H7N7中檢測到，而在H9N2病毒中比較罕見，在4株新H7N9病毒中，均發現了該PB2-627K突變[3-5]。在NA蛋白的莖區，4種新H7N9病毒均觀察到了69～73位氨基酸的刪除，這種現象過去曾發生在病毒適應陸生鳥類的案例中，提示H7N9病毒在感染人之前可能在陸生禽類中循環[5]。

總之，從生物進化的角度看，新發現的4種H7N9病毒已經攜帶了若干哺乳動物流感病毒的特征，其潛在的流行能力需要引起關注[5,6]。

3 流行病學

H7亞型的AIVs可分為北美譜系和歐亞譜系，其感染人的第一次報道發生于1959年，美國一名男性肝炎患者血液中分離到了H7N7病毒。1996年，又從美國一名患結膜炎的女性體內分離到禽源的H7N7。2003年以前，H7亞型感染人的報道很少，一般為實驗室感染[1]。在歐亞譜系，2003年春天，荷蘭發生了人群中大規模的H7N7亞型感染，導致86人感染。癥狀主要為結膜炎[1]。

最近暴發的H7N9禽流感病毒疫情，始于3月31日3例人感染H7N9的報道，患者均出現嚴重的肺炎和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)[3,6]，至4月23日，全國共報告108例確診病例，分布于北京(1例)、上海(33例，死亡12例)、江蘇(24例，死亡3例)、浙江(42例，死亡6例)、安徽(4例，死亡1例)、山東(1例)、河南(3例)7省市。目前病例處于散發狀態，尚未發現人傳人的證據。

3.1 傳染源目前已經在禽類及其分泌物或排泄物分離出H7N9禽流感病毒，與人感染H7N9禽流感病毒高度同源，傳染源可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類。目前已發現2例家庭聚集性病例，一宗為首批報告確診感染H7N9的87歲患者家庭，另一宗是一對夫妻先后被確診為感染H7N9的家庭，但這些證據仍不足以代表H7N9病毒已經具有了人傳人的能力。

3.2 傳播途徑經呼吸道傳播，也可通過密切接觸感染的禽類分泌物或排泄物，或直接接觸病毒感染。

3.3 高危人群在發病前1周內接觸過禽類者，例如從事禽類養殖、販運、銷售、宰殺、加工業等人員。

4 臨床表現

中國國家衛生和計劃生育委員會2013年4月3日印發人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第1版)、防控方案及醫院感染預防與控制技術指南。并于2013年4月10日再次發布人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)，以指導禽流感的診斷和防治。根據該方案，流感的潛伏期及現有H7N9禽流感病毒感染病例的調查結果，潛伏期一般為7d以內。

患者一般表現為流感樣癥狀，如發熱、咳嗽、少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病情發展迅速，多在5～7d天出現重癥肺炎，體溫大多持續在39℃以上，呼吸困難，可伴有咯血

痰；可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、感染性休克，甚至多器官功能障礙，部分患者可出現縱隔氣腫、胸腔積液等[2]。

5 實驗室檢查[2]

5.1 血常規白細胞總數一般不高或降低。重癥患者多有白細胞總數及淋巴細胞減少，可有血小板降低。

5.2 血生化檢查多有肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶升高，C反應蛋白升高，肌紅蛋白可升高。

5.3 病原學及相關檢測對于H7N9病毒的檢測，目前主要是通過反轉錄PCR方法檢測病毒RNA。由于核酸檢測是直接檢測病原體RNA，具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優點，為疾病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。相關試劑盒研制難度較低，目前已有文獻報道使用實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，real time RT-PCR)檢測H7N9病毒[8]。

診療方案要求，抗病毒治療之前必須采集呼吸道標本送檢(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、氣管吸出物或呼吸道上皮細胞)。有病原學檢測條件的醫療機構應盡快檢測，無病原學檢測條件的醫療機構應留取標本送指定機構檢測。

5.3.1 甲型流感病毒抗原篩查呼吸道標本甲型流感病毒抗原快速檢測陽性。但僅可作為初篩實驗。

5.3.2 核酸檢測對患者呼吸道標本采用real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒核酸。real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探針見表1[9]。

表1 real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探針

5.3.3 病毒分離從患者呼吸道標本中分離H7N9禽流感病毒。

5.3.4 動態檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高[2]。

6 診斷與鑒別診斷[2]

6.1 診斷根據流行病學接觸史、臨床表現及實驗室檢查結果，可作出人感染H7N9禽流感的診斷。在流行病學史不詳的情況下，根據臨床表現、輔助檢查和實驗室檢測結果，特別是從患者呼吸道分泌物標本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性，或動態檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的診斷[2]。

6.1.1 流行病學史發病前1周內與禽類及其分泌物、排泄物等有接觸史。

6.1.2 診斷標準

6.1.2.1 疑似病例符合上述臨床表現，甲型流感病毒抗原陽性，或有流行病學接觸史。

6.1.2.2 確診病例符合上述臨床表現，或流行病學接觸史，并且呼吸道分泌物標本中分離出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性或動態檢測雙份血清H7N9禽流行病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高。

6.2 鑒別診斷應注意與人感染高致病性H5N1禽流感、季節性流行感(含甲型H1N1流感)、細菌性肺炎、傳染性非典型肺炎(SARS)、新型冠狀病毒肺炎、腺病毒肺炎、衣原體肺炎、支原體肺炎等疾病進行鑒別診斷。鑒別診斷主要依靠病原學檢查。

7 結束語

目前，針對H7N9禽流感病毒的研究已經獲得了一定的成果，為下一步更有效地防控流感大流行提供了大量信息，但對于其病毒進化、傳播途徑、致病機制和流行規律等方面還了解不多和不深，需要進一步地深入研究。

[1]朱聞斐,高榮保,王大燕,等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學報, 2013,29(3):245-249.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案[S].第2版.2013.

[3]Gao R,Cao B,Hu Y,et al.Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A(H7N9)Virus[J].N Engl J Med,2013,[Epub ahead of print].

[4]He J,Ning L,Tong Y.Origins and evolutionary genomics of the novel 2013 avian-origin H7N9 influenza A virus in China:Early findings[EB/OL].arXiv:1304.1985v2[2013-04-09].

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[9]WHO.Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus[S].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.

Infections and laboratory diagnosis of H7N9 avian influenza

DONG Xiaoyi,SUN Changgui.Department of Clinical Laboratory, 117th Hospital of PLA，Hangzhou 310013,China

Novel avian influenza virus of the H7N9 subtype has infected 108 and killed 21 people in China as of April 23, 2013.Scientists have found that the influenza A(H7N9)virus was derived from a reassortment of 3 strains of AIV,and substantial mutations have been detected.These influenza A(H7N9)virus possess several characteristic features of mammalian influenza viruses,which are likely to contribute to their ability to infect humans and raise concerns regarding their pandemic potential.This paper briefly reviews recent progress in the biological characterization,epidemiology,clinical manifestation and laboratory diagnosis of this highly virulent virus.

H7N9;Avian influenza virus;Infection

R511.7,R373.1+3

A

1674-1129(2013)02-0105-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.001

董曉毅，男，1974年生，主管技師，博士，從事臨床微生物學檢驗。

孫長貴,碩士研究生導師，主任技師，教授,suncgui@163. com