CD147－shRNA重組質粒對裸鼠肝癌細胞SMMC－7721皮下移植瘤的抑制作用

田 廣，劉晶晶，房學東，宮路路＊

（1.梅河口市中心醫院，吉林 梅河口 135000；2.吉林大學第二醫院 普通外科，吉林 長春 130041）

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤，惡性度高，常規治療方法較難取得良好的預后，針對腫瘤細胞的靶向治療研究更顯突出。CD147是一種與肝癌密切相關的單次跨膜糖蛋白，參與腫瘤細胞的浸潤轉移。本實驗通過將本室前期構建的CD147－sh RNA轉染至肝癌細胞SMMC－7721，接種到裸鼠皮下組織內觀察腫瘤的生長情況，進一步證實CD147－sh RNA重組質粒在體內的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 細胞和質粒 p BS／U6由斯坦福大學孫自捷教授惠贈；pBS／U6／CD147－sh RNA3本室構建并保存［1］；肝癌細胞SMMC－7721由東北師范大學遺傳所 提 供；SMMC－7721／pBS／U6 及 SMMC－7721／p BS／U6／CD147－shRNA3分別為轉染空質粒和轉染重組質粒pBS／U6／CD147－sh RNA3的細胞株，由本室轉染成功并保存；

1.2 試驗動物 BALB／c－nu／nu小鼠24只，雄性，5周齡，體重15－20 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由東北師范大學細胞和遺傳所飼養。

1.3 動物飼養 裸鼠飼養在無特定病原 （specificpathogen free，SPF）層流柜中，調節室溫為26－28℃，相對溫度保持在40%－60%，定期通風，每日維持10小時光照，14小時無光的明暗周期；室內定期進行紫外燈照射，籠具、墊料、飲水、飼料均高壓蒸汽消毒，每周清潔籠具和墊料，飲水、飼料均經滅菌處理，飲水中加入復合維生素（例如，每1 000 ml加入1 ml各種維生素）。

1.4 動物分組 將24只裸鼠按數字表法隨機分成3組，每組8只；其中A組接種SMMC－7721細胞；B組 接 種 SMMC－7721／pBS／U6－control；C 組 接 種SMMC－7721／p BS／U6／CD147－sh RNA3。

1.5 裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型建立 取對數生長期（50%－70%面積）的三種細胞，用0.25%胰酶消化，PBS洗兩次，1 000 rpm離心5 min，收集細胞；用0.9%的生理鹽水懸浮細胞，定容；以5×106／0.2 ml分別接種于裸鼠前腿腋下皮下組織內，用微量注射器注入，形成直徑3 mm左右的皮下隆起。

1.6 裸鼠成瘤情況觀察 種植完成后每日觀察接種腫瘤生長情況，觀察注射部位有無感染及腫瘤自然消退；成瘤后每5 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）及短徑（b），取各組長短徑平均值，計算腫瘤體積。計算公式為體積（V）＝a×b2／2。40 d時處死裸鼠，取出瘤塊進行稱重，大體觀察移植瘤的形態并拍照，計算抑瘤率：公式為（對照組種植瘤質量－CD147－sh RNA轉染組種植瘤質量）／對照組種植瘤質量×100%。

1.7 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

平均8－10 d裸鼠腋窩皮下接種處出現瘤塊，直徑2－4 mm，成瘤率100%，隨著飼養時間的延長，瘤塊逐漸增大，無自發消退現象。飼養30－35 d時A組和B組分別有兩只裸鼠死于腫瘤惡液質。

根據每周觀察裸鼠腫瘤生長情況繪制腫瘤體積生長曲線，如圖1所示，A組和B組生長速度大至相同，兩組間無明顯差異；而C組生長速度明顯慢于A組及B組。從20 d開始C組瘤塊平均體積生長明顯慢于A、B組，體積差別有統計學差異。見表1。

圖1 裸鼠腫瘤體積生長曲線

表1 三組裸鼠種植瘤塊平均體積（±s）組別 n瘤塊平均體積（mm3）5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 35 d 40 d A 6 0 31.6±7.6 62.1±28.6 153.3±76.7 205.9±132.0 258.1±100.3 402.8±104.1 559.5±120.2 B 6 0 32.9±12.8 47.8±19.1 143.1±58.1 175.0±73.7 253.5±111.2 358.4±95.5 523.1±153.6 C 8 0 27.6±5.8 37.3±6.5 60.4±15.7＊ 83.5±26.6＊ 109.8±35.7＊ 160.6±76.3＊ 193.5±73.7＊注：與A組及B組相比，＊P＜0.05

飼養40 d時統一處死裸鼠，取出皮下瘤塊，大體觀察腫瘤呈粉紅色，表面凹凸不平，呈結節狀，切面為灰白色；將瘤塊進行稱重，A組和B組間無明顯差異，C組裸鼠之瘤塊重量明顯小于A組和B組，有統計 學 差 異；與 A 相 比，SMMC－7721／p BS／U6－CD147－sh RNA3細胞在裸鼠體內所成腫瘤生長明顯減緩，抑瘤率為64.8%。見表2。

表2 三組裸鼠種植腫瘤瘤塊40 d時平均重量（±s）及抑瘤率

表2 三組裸鼠種植腫瘤瘤塊40 d時平均重量（±s）及抑瘤率

注：與A組及B組相比，＊P＜0.05

組別 n 腫瘤重量（mg） 抑瘤率（%）A 6 2327.3±812.4 B 6 2203.3±552.9 C 8 819.2±289.9＊64.8

3 討論

裸鼠皮下移植瘤模型是常用的一種腫瘤實驗研究模型，具有方法簡便，成瘤率高，易于觀察、測量等優點，因而在腫瘤研究中得了廣泛應用。本試驗中我們將肝癌細胞系SMMC－7721及轉染空質粒的SMMC－7721／PBS／U6和轉染重組質粒的 SMMC－7721／pBS／U6／CD147－sh RNA3三種細胞接種于裸鼠皮下以觀察腫瘤生長情況。

裸小鼠（nude mice）由于無胸腺而僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮，導致缺乏成熟的T淋巴細胞，因而細胞免疫功能低下，BALB／c－nu是目前常用裸小鼠品系，裸鼠用作腫瘤種植實驗，方法簡單，無需對動物作特殊前處理，而且異種腫瘤種植成功率相當高。本試驗中接種的腫瘤細胞全部成瘤，種植傳代后的腫瘤組織仍保留其原有的生物學特性，種植瘤可以一直在裸鼠體內或體表生長。裸鼠皮下接種后形成的瘤體不與皮膚及皮下組織粘連，極易分離便于觀察、測量和活體檢查，一般選擇腋下接種，此部分血供豐富，有利于腫瘤生長；瘤塊成長后方便取出進行測量。本試驗是采用腋窩皮下接種。

我們將腫瘤細胞按5×106／0.2 ml分別接種于裸鼠前腿腋下皮下組織內，每天觀察裸鼠生長情況，約8－10 d后所有裸鼠均有腫瘤生長，直徑約3－4 mm，成瘤率100%，每5 d測量一次腫瘤組織大小。接種后30 d左右時A組和B組各有兩只裸鼠死于腫瘤惡液質狀態。40 d時處死全部裸鼠并切取腫瘤觀察腫瘤生長情況，轉染CD147－sh RNA3后的SMMC－7721細胞腫瘤生長較慢，且CD147表達明顯減弱，提示通過RNAi干擾肝癌細胞SMMC－7721的CD147表達后，可以抑制腫瘤生長，抑瘤率可達68.4%。證實CD147在肝癌的發展過程中起了很大作用，而通過RNAi技術抑制肝癌細胞中CD147的表達對抑制腫瘤的生長和浸潤轉移取得良好的效果。由于CD147在正常組織幾乎不表達，而在腫瘤組織中表達明顯增高，我們構建的CD147－sh RNA3具有靶向性、特異性，而對正常組織幾乎無不良影響。轉染重組質粒組裸鼠腫瘤較對照組有統計學差異，但腫瘤仍呈漸進性生長，也印證了不可能通過抑制單一基因的表達而治愈腫瘤。但該模型的不足之處是不能模擬HCC中復發轉移等生物學特征。

本試驗中選擇了CD147做為靶基因進行干預，取得了較好的效果。但肝癌的發生發展是多基因多步驟的復雜過程，一些相關研究表明，應用RNAi技術抑制另外一些與肝癌關系密切相關的基因，如survivin［2］、h TERT［3］、MDR［4］等，也為肝癌的基因治療提供了靶點。我們的試驗則提供了另一個重要的干預靶點。

［1］宮路路，林瑞新，李曉萌，等.CD147－shRNA對肝癌細胞CD147表達的抑制作用［J］.中國普通外科雜志，2010，19（1）：41.

［2］Cheng SQ，Wang Wl，Yan W，et al.Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in hunan hepatocellular carcinoma cell line SMMC－7721［J］.World J Gastroenterol，2005，11（5）：756.

［3］Zhang PH，Zou L，Tu ZG.RNAi－h TERT inhibition hepatocellular carcinoma cell proliferation via decreasing telomerase activity［J］.J Surg Res，2006，131（1）：143.

［4］Chen XP，Wang Q，Guan J，et al.Reversing multidrug resistance by RNA interference through the suppression of MDR1 gene in human hepatoma cells［J］.World J Gastroenterol，2006，12（21）：3332.