雙靶向TRAIL過表達聯合輻射對乳腺癌MDA－MB－435細胞增殖和凋亡的影響

王 巍，陳文慶，王長青，徐貴穎

（吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130012）

自1992年美國學者Weichaelbaum首次提出腫瘤基因－放射治療以來，經過近二十年的不斷探索和發展，取得了非常的進步。其基本理念是將腫瘤的基因治療引入到放射治療中，實現二種療法對腫瘤的雙重作用［1］。腫瘤基因－放射治療中如何選擇治療基因和提高基因的表達效率是非常關鍵的兩個問題。本研究以腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF－related apoptosis inducing ligand，TRAIL）為治療基因，以其增加放療時射線誘導的乳腺癌細胞凋亡作用。另外，研究發現［2－4］條件復制型腺病毒作為載體時能夠特異性感染腫瘤細胞，而對正常細胞無此作用，顯著增加腫瘤細胞中目的基因的表達效率。而且，人端粒酶逆轉錄酶（human relomerase reverse transcriptase，h TERT）基因啟動子屬于腫瘤特異性啟動子，將其置于腺病毒調控復制部分則能實現腫瘤細胞內高效復制［5］。因此，本研究利用h TERT和Egr－1啟動子雙靶向介導TRAIL基因，進而觀察對輻射誘導乳腺癌MDA－MB－435細胞增殖和凋亡的影響，為乳腺癌的基因－放射治療提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

人乳腺癌MDA－MB－435細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞研究所；攜帶TRAIL的條件復 制 型 腺 病 毒 （載 體 為 pShuttle－Egr1－TRAIL－h TERT－E1A－E1Bp－E1B55K，命名為 CRAd.p Egr－1－TRAIL）由吉林大學衛生部放射生物學重點實驗室王志成博士惠贈；高糖DMEM、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gibco公司，美國）；CCK8試劑盒（DOjin DO公司，日本）；AnnexinⅤ－FITC試劑盒（南京凱基生物）；國產 X 射線深部治療機（XSZ－220／20X型，丹東市康嘉儀器設備有限公司）；酶標儀（Bio－Rad公司，美國）和流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 實驗分組、病毒感染和照射

實驗分為正常對照組（Control）、CRAd.p Egr－1－TRAIL 組、2.0 Gy 照 射 組 及 CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy照射組。乳腺癌 MDA－MB－435細胞培養與含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素和鏈霉素高糖DMEM培養基中，培養條件為37℃，5%CO2；待細胞80%－90%融合后將細胞用胰酶消化后接種于96孔（2×104個／孔）和6孔培養板中（1×106個／孔），24 h后按照預實驗和參考文獻［6］。進行病毒感染，感染滴度為5 MOI［Multiplicity of infection（virus／cell）］，24 h后進行 X 射線照射。照射條件為200 k V電壓，10 m A電流，濾板為0.5 mm Cu和1.0 mm Al，靶皮距離為50 cm，劑量率為0.287 Gy／min。

1.3 CCK－8試劑盒檢測細胞增殖

采用CCK－8試劑盒檢測細胞增殖，按照實驗分組 MDA－MB－435細胞進行 CRAd.p Egr－1－TRAIL病毒感染和照射，照射后6、12、24和48 h按照說明書加入10μl／孔CCK－8試劑，繼續培養1 h，輕輕震蕩，酶標儀于490 nm處檢測各孔吸光度A490值，以此表示細胞增殖能力［7］。

1.4 AnnexinⅤ／FITC試劑盒檢測細胞凋亡

采用AnnexinⅤ／FITC試劑盒檢測細胞凋亡，按照實驗分組 MDA－MB－435細胞進行CRAd.p E－gr－1－TRAIL病毒感染和照射，照射后24 h收集細胞于玻璃離心管中，PBS洗2次后棄上清，每個離心管中加入500μl緩沖液重懸細胞沉淀，加入5μl Annexin V－FITC和5μl PI，混勻，室溫避光反應5－15 min，2 h內上機檢測，每個樣品收取1.0×104個細胞。CellQuest軟件收集并分析數據，結果以細胞百分比表示。

1.5 統計學處理

實驗數據以平均值±標準差表示，利用SPSS17.0統計軟件one－way ANOVA檢驗進行分析，P＜0.05或P＜0.01表示具有統計學差異。

2 結果

2.1 MDA－MB－435細胞增殖能力的變化

由表1可見，隨時間的延長各組MDA－MB－435細胞（CRAd.p Egr1－TRAIL＋2.0 Gy組48 h除外）均顯示增殖狀態，control和 CRAd.p Egr－1－TRAIL組基本一致；而2.0 Gy和CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy組細胞增殖放緩，尤其是 CRAd.p Egr－1－TRAIL＋2.0 Gy組甚至在48 h時出現抑制。12 h時，CRAd.p Egr1－TRAIL ＋2.0 Gy組細胞增殖較control組顯著增加（P＜0.05），24和48 h時，2.0 Gy組和 CRAd.p Egr1－TRAIL ＋ 2.0 Gy組也較control組顯著增加 （P＜0.05，P＜0.01），且CRAd.p Egr1－TRAIL ＋2.0 Gy組較2.0 Gy組顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

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2.2 MDA－MB－435細胞凋亡百分比的變化

圖1為各組細胞經過流式細胞術分析所得到直方圖，進一步分析得到各組細胞凋亡百分比變化，分別為：control組 （3.31±0.58）、CRAd.p Egr1－TRAIL組（5.53±0.69）、2.0 Gy組（9.33±1.01）和 CRAd.p Egr1－TRAIL＋2.0 Gy 組 （14.23±1.34），其中2.0 Gy和 CRAd.pEgr1－TRAIL＋2.0 Gy組較control組增加顯著（P＜0.05，P＜0.01），CRAd.pEgr1－TRAIL＋2.0 Gy組較2.0 Gy組增加顯著（P＜0.05）。以上結果說明電離輻射能誘導MDA－MB－435細胞凋亡，且雙靶向TRAIL過表達能增加輻射誘導凋亡能力。

圖1 The apoptotic percentage changes of MDA－MB－435 cells in different groups after 2.0 Gy X－rays irradiation

3 討論

乳腺癌在女性惡性腫瘤中排名第1位，占女性新發惡性腫瘤的30%［8］。放射治療是乳腺癌臨床治療的重要手段之一，但是往往因為周圍正常組織的損傷和腫瘤自身輻射耐受影響放療療效，所以單獨的放射治療存在一定的限制［9］。腫瘤基因－放射治療是聯合基因治療和放射治療的一種新型腫瘤治療方法，目前已經吸引了廣大科研工作者的興趣，具有廣闊的應用前景［1］。但是目的基因的選擇和靶向性一直是非常關鍵，如果能夠有效的解決它們，則對這種療法的進步具有重要意義。

腫瘤基因－放射治療的目的不僅包括抑制細胞增殖，同時也要誘導細胞死亡。凋亡是細胞死亡的方式之一，電離輻射可以直接誘導腫瘤細胞凋亡，并且誘導細胞周期檢查點的阻滯，這是臨床腫瘤放射治療的基礎。用一定的放射治療策略啟動細胞凋亡能夠有效地抑制腫瘤細胞的生長，這對腫瘤放療非常有意義［10］。TRAIL基因就是一個腫瘤細胞高效的誘導凋亡基因，而對正常細胞則無此作用，因此，本研究以其為靶基因，進行乳腺癌基因放射治療的研究。另外，h TERT作為腫瘤特異性啟動子可以用來作為條件復制型腺病毒腫瘤內特異性表達的啟動子，而且還利用早期生長因子（early growth response 1，Egr－1）啟動子來介導TRAIL的輻射誘導表達，由此實現TRAIL的雙靶向性過表達，這一思路已有文獻表明，且效果較好［6］。本實驗采用人乳腺導管癌細胞 MDA－MB－435作為研究對象，探討雙靶向TRAIL過表達對輻射誘導的細胞增殖和凋亡的影響，為乳腺癌的放射治療提供必要的實驗數據。

本實驗的結果顯示，感染CRAd.p Egr1－TRAIL病毒對 MDA－MB－435細胞的增殖能力無明顯影響，而對凋亡則能夠誘導增加的趨勢，可能和病毒感染只有24 h，病毒復制的量不夠有關；2.0 Gy照射后細胞增殖受到抑制，且能夠誘導細胞凋亡的顯著增加（P＜0.05），并且感染該病毒后再給予2.0 Gy的照射，細胞增殖抑制的更明顯，且細胞凋亡增加的更顯著（P＜0.01），這說明二者對抑制細胞增殖和誘導凋亡起到了協同的作用。上述結果對乳腺癌的基因－放射治療起到重要的啟示，選擇高效的治療基因和提高腫瘤的靶向性，能夠顯著增加治療效果。

［1］Zheng AQ，Song XR，Yu JM，et al.Liposome transfected to plasmid－encoding endostatin gene combined with radiotherapy inhibits liver cancer growth in nude mice［J］.World J Gastroenterol，2005，11（28）：4439.

［2］Yang SW，Cody JJ，Rivera AA，et al.Conditionally replicating adenovirus expressing TIMP2 for ovarian cancer therapy［J］.Clin Cancer Res，2011，17（3）：538.

［3］Zheng FQ，Xu Y，Yang RJ，et al.Combination effect of oncolytic adenovirus therapy and herpes simplex virus thymidine kinase／ganciclovir in hepatic carcinoma animal models［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30（5）：617.

［4］Yang SW，Chanda D，Cody JJ，et al.Conditionally replicating adenovirus expressing TIMP2 increases survival in a mouse model of disseminated ovarian cancer［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25131.

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［6］王宏芳，劉揚，李金華，等.雙重靶向條件復制型腺病毒的包裝及抗腫瘤作用［J］.西安交通大學學報（醫學版），2013，34（3）：308.

［7］Li Y，Guo C，Wang Z，et al.Enhanced effectes of TRAIL－endostatin－based double－gene－radiotherapy on suppressing growth，promoting apoptosis and inducing cell cycle arrest in vascular endothelial cells.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（2）：153.

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