不同發酵天數對“栓錢菌質”急性毒性及抗炎、鎮痛作用的影響

彭 薇， 孫 鈺， 潘 揚， 張 弦， 蔣亞平

（南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210029）

中藥馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nuxvomica L.的干燥成熟種子，2010版《中國藥典》記載其性溫，味苦，具通絡止痛、散結消腫之效[1]，是中醫臨床常用的活血化瘀藥。現代研究表明，馬錢子具有較好的鎮痛、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[2-3]，其主要有效成分是生物堿類，包括士的寧、馬錢子堿、士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物等。由于馬錢子“其毒甚烈”（《醫學衷中參西錄》），故臨床內服須用其炮制品。“雙向發酵”是作者所在實驗室創立的一種使藥用真菌與藥材組合進行固體發酵以生產藥物的現代生物技術[4]，它為毒性中藥“降毒存效”開辟了一條新途徑[5]。前期作者運用該項技術對馬錢子進行發酵減毒研究，已證實其經朱紅栓菌Trametes cinnabarina發酵后形成的發酵品 （簡稱為“栓錢菌質”）中多種原有的生物堿成分發生了質和量的變化，毒性較大的士的寧和馬錢子堿含量呈現下降趨勢[6]；而毒性相對較小的士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加[7]。藥理實驗也表明:與馬錢子生品相比，“栓錢菌質”毒性有所降低且保持了其原來的鎮痛、抗炎作用[8]，這就說明馬錢子發酵減毒與目前公認的炮制機理[9]基本相同。

一般認為，為了獲得最佳發酵產品，當“栓錢菌質”的發酵終點達到時，必須終止發酵過程；如果發酵時間（天數）過長或過短，其降低毒性和提高（保持）藥效的效應必將相應變差。本實驗比較不同發酵天數“栓錢菌質”急性毒性及抗炎、鎮痛作用的差別，旨在為其發酵終點的確定提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材與藥品

馬錢子藥材 （生品），購自南京市藥業股份公司，經潘揚教授鑒定為馬錢科植物Strychnos nuxvomica L.的干燥成熟種子；吲哚美辛片，購自上海信誼九福藥業有限公司。

1.2 儀器與試劑

AE240電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司產品；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；超凈工作臺，江蘇無錫空氣凈化設備廠產品；微型高速萬能粉碎機，河北省黃驊市齊家務科學儀器廠產品；巴豆油，杭州中香化學試劑有限公司提供；羧甲基纖維素鈉，國藥集團試劑有限公司提供；水為純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物與菌種

ICR小鼠，由揚州大學比較醫學中心提供；朱紅栓菌 Trametes Cinnabarina（Jacq.:Fr.） Fr.，由南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所分離、鑒定、保藏并復壯。

1.4 “栓錢菌質”制備

按雙向固體發酵的制備工藝進行操作[10-11]。將馬錢子粉碎成粗粒（過10目篩）5 g，加適量水稍潤濕，pH 自然，填裝入粗試管（φ 32 mm×200 mm），混合均勻，扎口，121℃高壓滅菌50 min，冷卻；從菌種斜面上切取綠豆粒大小的菌絲體（帶培養基）一塊，移入發酵基質的表面（使二者需有接觸），扎口，置于培養箱中27℃恒溫培養。每天嚴密觀察紅栓菌在馬錢子（基質）上的生長情況，分別在發酵至第0、7、20、41、48、62、69 天時， 掏取試管中的發酵物，60 ℃下干燥 4～6 h，即得“栓錢菌質”（簡寫為“SQJZ”），低溫避光（4℃冰箱）保存。

1.5 試液配制

1.5.1 藥品混懸液的配制 馬錢子生品和不同時間段的發酵品，先粉碎成粗顆粒，然后加同等質量的藥用淀粉混合均勻，再粉碎過80目篩，加質量分數0.5%CMC-Na水溶液配成混懸液。使用前劇烈振搖1～2 min使均勻。

1.5.2 體積分數0.5%醋酸溶液的配制 精密量取冰醋酸0.5 mL，加蒸餾水使溶散成100 mL，即得，密閉保存。

1.5.3 體積分數2%巴豆油溶液的配制 精密量取巴豆油2 mL，加乙醚73 mL、無水乙醇20 mL使溶散，加蒸餾水至100 mL，即得，低溫密閉保存。

2 實驗方法

2.1 急性毒性實驗

將不同發酵天數“栓錢菌質”的7個樣品分別進行實驗。每個樣品取18～22 g小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組10只，以預試驗結果選擇適當的組數（5～6組）和劑距。實驗前小鼠禁食（不禁水）12 h后，以0.2 mL/10 g的劑量灌胃給予不同濃度的藥物，觀察并記錄給藥后7 d內小鼠的精神、活動、飲食、飲水、毛色、二便及死亡等情況，死亡動物及時進行尸檢，采用 LD50 CALC（Ver.2.0）軟件（Bliss法）計算半數致死量（LD50）和95%可信限；并按下式計算不同發酵天數“栓錢菌質”相對于馬錢子生品的毒性下降率（%）。

2.2 鎮痛作用

醋酸腹腔注射致小鼠扭體試驗[12]:取體質量20～24 g雄性小鼠100只，按體質量隨機分為10組，每組10只:①模型空白對照組（質量分數0.5%CMCNa水溶液20 mL/kg）；②陽性對照組 （吲哚美辛20 mg/kg）；③生馬錢子藥材組（按生藥計20 mg/kg）；④—⑩分別為發酵 0、7、20、41、48、62、69 d 的“栓錢菌質”（按發酵品計20 mg/kg），各組給藥體積按20 mL/kg一次性灌胃。給藥后0.5 h，各組小鼠腹腔注射體積分數0.5%醋酸溶液0.2 mL/只，觀察并記錄注射醋酸15 min內各小鼠發生扭體反應（腹部內凹、軀干與后腿伸張、臀部高起）的次數。

2.3 抗炎作用

對巴豆油所致鼠耳腫脹的影響[12]:取體質量20～24 g雄性小鼠100只，按體質量隨機分為10組，每組10只:①模型空白對照組（質量分數0.5%CMC-Na水溶液20 mL/kg）；②陽性對照組（吲哚美辛20 mg/kg）；③生馬錢子藥材組（按生藥計20 mg/kg）；④—⑩分別為發酵 0、7、20、41、48、62、69 d 的“栓錢菌質”（按發酵品計20 mg/kg），各組每日灌胃1次，給藥體積按20 mL/kg，連續給藥4 d。末次給藥0.5 h后，用體積分數2%巴豆油溶液0.05 mL涂于小鼠右耳兩側，左耳不涂作為正常對照。致炎后4 h，將小鼠頸椎脫臼致死，自耳廓剪下左、右兩耳，用打孔器（直徑9 mm）分別在兩耳的同一部位打一圓耳片，電子天平稱質量（精確至0.1 mg），記錄每鼠左右耳片的質量（mg），計算其耳廓腫脹度（即每鼠右耳片質量減去左耳片質量）（mg），并按下式得出耳廓腫脹下降率（%）。

2.4 統計學方法

以上鎮痛、抗炎結果采用SPSS 17.0統計軟件處理，耳廓腫脹度（mg）和扭體次數計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA），方差齊者采用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2法，P＜0.05者為差異有顯著意義。

3 結果與分析

3.1 實驗結果

3.1.1 對急性毒性的影響 各組小鼠灌服不同發酵天數藥液后，均出現不同程度的興奮癥狀，如活動明顯增多、煩躁不安，甚至驚厥、抽搐而死亡，死亡時間一般在30 min內。低劑量小鼠中毒潛伏期較長，多在3～5 h后死亡，有的給藥后小鼠反復抽搐而不死亡，后逐漸恢復正常，其活動、飲食及精神狀態也與未給藥小鼠基本相同。對中毒死亡小鼠進行解剖后未發現病變組織。不同發酵天數“栓錢菌質”毒性下降率（%）大小如下:0 d≈7 d＜20 d≈41 d＜48 d＜62 d＜69 d。 不同發酵天數“栓錢菌質”的 LD50值和毒性下降率見表1。

表1 不同發酵天數“栓錢菌質”的急性毒性Table 1 Effect of fermentation days in the acute toxicity of SQJZ

3.1.2 對鎮痛作用的影響 扭體反應次數大小如下: 空白≥69 d≈62 d＞48 d＞41 d≈20 d＞0 d＞7 d＞生品＞吲哚美辛，且與空白對照相比，生品，發酵0、7、20、41、48 d者均明顯減少醋酸致小鼠扭體反應次數（P＜0.05），表明發酵48 d內鎮痛作用沒有明顯下降；而62 d和69 d者則鎮痛作用消失，與陽性對照（吲哚美辛）相比有極顯著性差異（P＜0.01）。扭體反應次數數據見表2。

3.1.3 對抗炎作用的影響 耳廓腫脹率（%）大小如下:空白≥69 d＞62 d＞20 d＞7 d≈0 d＞48 d＞41 d＞生品＞吲哚美辛，且與空白對照相比，生品，發酵0、7、20、41、48 d者均可顯著抑制致炎后小鼠的耳廓腫脹率（P＜0.05或0.01），表明發酵48 d內抗炎作用沒有明顯變化。耳廓腫脹度（mg）及耳廓腫脹率（%）數據見表2。

3.2 結果與討論

實驗結果表明，不同發酵天數“栓錢菌質”毒性下降率（%）大小如下:發酵 0 d≈7 d＜20 d≈41 d＜48 d＜62 d＜69 d。扭體反應次數大小如下:發酵69 d≈62 d＞48 d＞41 d≈20 d＞0 d＞7 d； 與空白對照相比， 發酵 0、7、20、41、48 d 者與馬錢子生品一樣，均明顯減少醋酸致小鼠扭體反應次數（P＜0.05），表明發酵48 d內基本保留了生品原有的鎮痛作用；而62 d和69 d者則此活性消失，且與陽性對照（吲哚美辛）相比有極顯著性差異（P＜0.01）。耳廓腫脹下降率（%）大小如下:發酵 7 d≈20 d＞41 d＞48 d＞0 d＞＞62 d＞69 d，與空白對照相比，發酵 0、7、20、41、48 d者與生品相同，皆可顯著抑制致炎后小鼠的耳廓腫脹率（P＜0.05或0.01），表明發酵48 d內抗炎作用沒有明顯變化。

表2 不同發酵天數“栓錢菌質”的鎮痛和抗炎作用Table 2 Effect of fermentation days on the analgesic and anti-inflammatory effects of SQJZ

表面上看，發酵62 d和69 d者急性毒性下降率雖然分別達162.7%和205.4%，毒性相比馬錢子生品下降幅度較大，但實質上二者的鎮痛和抗炎作用已喪失，故仍以48 d或41 d者（毒性下降率各為77%和28.6%）為佳。另外，比較分析發酵41 d和48 d“栓錢菌質”的鎮痛和抗炎作用，除了這二者的兩種作用與馬錢子生品保持基本一致外，41 d者鎮痛作用稍強；而48 d者抗炎作用略勝。

4 結語

綜上所述，“栓錢菌質”制備所需發酵天數要控制在一個合理的范圍內，發酵時間過短不能達到降低毒性的目的，而發酵時間過長則會影響馬錢子原有的臨床作用效果，因此最后確定其發酵終點應選擇在第41～48 d較適宜。至于其中有毒成分和有效成分質和量的變化，還有待于進一步深入研究。

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