樹干畢赤酵母基因組文庫的構建及纖維二糖酶基因的篩選

馬經緯 ， 張 梁 *， 薛 衛 ， 石貴陽

（1.工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；3.南京農業大學 信息科學技術學院，江蘇 南京 210095）

隨著分子生物學技術的迅猛發展，發現新基因、研究新基因的功能已經成為功能基因組研究的熱點。生物工程產業化更需要分離出有應用價值的新基因[1]。構建DNA基因組文庫是功能基因組學研究的基本手段，一個物種的基因組DNA包含了它所有的遺傳信息基因，可真實反映出基因組的全部信息[2]。基因組文庫不僅保存物種的遺傳信息，而且提供了一個篩選基因的平臺，可用于分離鑒定具有特定功能的基因[3-4]。

樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）不僅可以發酵木糖、葡糖糖、甘露糖、半乳糖，還可以發酵纖維二糖和木二糖，對于纖維質原料發酵產燃料乙醇具有重要意義[5-6]。樹干畢赤酵母已被證明具有良好的轉運和利用纖維二糖的能力，但該菌株產酒精的能力有限，無法在工業規模應用[7]。近年來也有許多學者通過改變發酵條件提高樹干畢赤酵母發酵產乙醇的得率，但其生產能力距工業化還有一定的距離，這就凸顯出通過基因手段改造得到理想菌株尤為重要。

目前，對于樹干畢赤酵母的木糖利用酶系的研究已經取得一定的進展，樹干畢赤酵母基因組測序也已經初步完成。但是，樹干畢赤酵母基因水平的研究正處于起步階段，許多關鍵的功能基因并沒有標注，能夠檢索到的文獻甚少。其中，在其轉運和利用纖維二糖方面的研究基本空白，僅推測得知該酵母基因組中有7個編碼β-葡萄糖苷酶的基因[8-9]。課題組前期根據文獻[9]對預測的7個基因進行了PCR擴增，并連接表達載體后轉入釀酒酵母進行表達驗證，但均未檢測獲得纖維二糖酶活性。

鑒于此，構建樹干畢赤酵母的DNA基因組文庫，不僅將樹干畢赤酵母的遺傳信息以穩定的重組體形式儲存起來，還可從中篩選、克隆和驗證出新基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 樹干畢赤酵母CBS 5773，大腸桿菌JM109，釀酒酵母W303-1A，均保藏于江南大學中國高校工業微生物資源和信息中心；載體YEpLac181，由作者所在實驗室保藏。

1.1.2 其他材料 蛋白胨和酵母膏，購自英國OXOID公司；蝸牛酶，購自Fermentas公司；Sau3AⅠ和BamHⅠ限制性內切酶，均購自NEB公司；氨芐青霉素，購自上海生工生物工程公司；X-Gal，IPTG，T4DNA連接酶，購自寶生物工程有限公司；其他試劑和藥品，均為國產或進口分析純。

1.2 樹干畢赤酵母染色體DNA的提取

接種樹干畢赤酵母于YEPD液體培養基中，30℃，200 r/min搖床過夜培養。取2 mL培養物至5 mL的離心管中，6 000r/min離心5min收集菌體；加入0.5mL酵母染色體提取試劑Ⅰ （0.1 mol/L Na2EDTA+0.9 mol/L山梨醇，pH 7.5）重懸菌體；加入30 μL的5 mg/mL蝸牛酶酶解細胞壁，37℃處理至大多數細胞形成原生質體；6 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入0.5 mL酵母染色體提取試劑Ⅱ（20 mmol/L Na2EDTA+50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4）重懸菌體，并加入50 μL質量分數10%SDS，65℃保溫30 min裂解細胞；加入200 μL 5 mol/L醋酸鉀溶液，冰浴1 h；8 000 r/min離心8 min；取上清液移至干凈離心管中，在冰上加入等體積的異丙醇，放置15 min；6 000 r/min離心5 min；棄上清液，用體積分數75%的酒精洗滌沉淀兩次；待沉淀物干燥后加入適量的TE緩沖液（pH 7.4）或無菌水使溶解沉淀，-4 ℃保存[10]。

1.3 載體的制備

堿裂解法大量提取YEpLac181質粒，經BamHⅠ酶切成線形，純化回收后用CIAP對YEpLac181/BamHⅠ去磷酸化處理。

1.4 樹干畢赤酵母基因組文庫的構建及驗證

采用微量稀釋法用內切酶Sau3AⅠ部分酶切基因組DNA，同時取處理為線性的質粒YEpLac181，Sau3AⅠ和BamHⅠ為同尾酶，利用T4DNA連接酶16℃將二者過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，涂布含100 μg/mL的氨芐青霉 素 、20 μL 100 mg/mL 的 IPTG 和 100 μL 20 mg/mL的X-gal的LB平板，37℃恒溫箱培養，隨機挑取白色菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃搖床過夜培養，提取出質粒BamHⅠ酶切電泳驗證。

1.5 基因組文庫的保存

將藍白斑篩選所得白色菌落計數，用無菌牙簽將平板上的白色單菌落分別挑至無菌的96孔板，每個孔有100 μL含100 μg/mL的氨芐青霉素 LB液體培養基，封口膜封死37℃恒溫箱過夜培養，加等體積的體積分數30%的甘油保存于-70℃。

1.6 基因組文庫的評估

根據所獲得的基因組文庫的克隆子的數目及平均插入片段的大小，依據公式:庫容量=文庫中陽性克隆子的數目×插人片段的平均大小／該生物基因組的大小計算出該基因組文庫的庫容量的大小。

根據Clarke-Carbon公式[11]，N為當要求的克隆概率為P時，一個基因組文庫中所需的含有重組DNA的克隆數；P為克隆概率，即任一DNA片斷至少一份拷貝存在于該文庫的概率；f為限制片斷的平均長度與基因組DNA總長度之比。計算基因組文庫中所需的含有重組DNA的克隆數。

1.7 從文庫中篩選纖維二糖酶相關基因

分別提取構建好的文庫大腸桿菌中的重組質粒，用醋酸鋰轉化法將所提的質粒轉入釀酒酵母W303-1A中做游離表達，涂布YNBC平板30℃培養4 d左右。

挑取能夠在YNBC平板生長的酵母轉化株接種于YEPD液體培養基30℃搖床過夜培養，pNPG法測定纖維二糖酶酶活[12]。每分鐘每毫升酶液水解產生1 μmol對硝基酚（pNP）所需要的酶量定義為一個酶活單位。方法如下:離心分離菌體和發酵液，將所得菌體用超聲波破碎儀破碎細胞，離心分離胞內液體和細胞碎片。分別取0.2 mL經適當稀釋或濃縮的發酵液上清液、細胞碎片和胞內液，加入1.8 mL 0.2 mol/L Na2HPO4+0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5），30℃預熱10 min后，加入已預熱的5 mmol/L對硝基酚-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）溶液2 mL，反應10 min后立即加入2 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應，室溫放置5 min后于400 nm處測定吸光度。以加熱失活的酶液按照同樣方法處理作空白。取轉化株所對應質粒的插入片段測序，得到纖維二糖酶相關基因序列。

1.8 生物信息學手段分析纖維二糖酶相關基因

將測序得到的堿基序列導入NCBI數據庫中的BLAST程序進行堿基同源性分析；將堿基序列翻譯成氨基酸利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）工具進行三維建模。

2 結果與分析

2.1 樹干畢赤酵母基因組文庫的構建

由于樹干畢赤酵母染色體基因組較大，用普通限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ等酶切8 h均未能獲得較為理想的片段組合。經過反復試驗，最終選擇采用Sau3AⅠ酶，該酶是識別4 bp的限制性內切酶，完全酶切會產生平均256 bp的片段。通過微量稀釋法設置時間梯度和酶活梯度，對染色體基因組進行酶切處理，確定了樹干畢赤酵母染色體基因的最佳酶切條件。

經質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樹干畢赤酵母染色體經限制性內切酶Sau3AⅠ稀釋100倍酶切6 h的片段大小在0.5 kb～8 kb之間，大多數片段在5 077 bp處，如圖1所示。

圖1 樹干畢赤酵母染色體經Sau3AⅠ酶切片段1%的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 P.stipitis chromosome digested by Sau3AⅠwas analyzed by electrophoresis on 1%agarose gel

隨機挑取藍白斑篩選所得白色菌落接種含100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃搖床過夜培養，提取出質粒BamHⅠ酶切質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，如圖2所示。

圖2 質粒經BamHⅠ酶切1%的瓊脂糖凝膠電泳，2為空載的線性化載體YEpLac181Fig.2 Plasmids digested by BamHⅠwas analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel，2 was YEpLac181 digested by BamHⅠ

共涂布10塊平板，每塊平板大約得300多個白斑，55個藍斑，共計得到300個陽性克隆子。根據公式計算出該基因組文庫的庫容量為:庫容量=3 000×5 000／15 441 179=97%。即該文庫中所含插入片段的總長度為樹干畢赤酵母基因組的0.97倍。

根據Clarke-Carbon公式，已知P=97%，即從該文庫篩選到樹干畢赤酵母任一DNA序列的精確概率為97%。計算得到N為1.08，即該文庫已經覆蓋了樹干畢赤酵母的所有基因。

2.2 纖維二糖酶相關基因的篩選

根據1.7步驟，篩選獲得唯一一株能夠在YNBC平板生長的釀酒酵母轉化株，接種YEPD液體培養基30℃過夜培養后，離心分離發酵液上清液和菌體，將菌體超聲波破碎離心分離胞內液和細胞碎片，pNPG法分別測定發酵液上清液、胞內液和細胞碎片的纖維二糖酶酶活，結果見表1。在細胞碎片中測到纖維二糖酶酶活，說明該基因編碼的蛋白質可在細胞間質處起作用。

表1 發酵液上清、細胞碎片和胞內液酶活比較Table 1 Cellobiase activity of supernatant of the medium，the cell wall and cell extracts

提取轉化株所對應的質粒，BamHⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示。將插入片段膠回收純化后測序，得到一段1 821bp的堿基序列。

圖3 轉化株對應質粒BamHⅠ酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Plasmid of transformation digested by BamHⅠwas analyzed by electrophoresis on 1%agarose gel

2.3 纖維二糖酶相關基因的分析

將測序得到的堿基序列導入BLAST程序沒有檢索到同源序列；利用SWISS-MODEL工具三維建模失敗。

3 結語

基因組文庫的構建載體的濃度和純度的高低都直接關系到文庫構建的成敗，空載的多少直接影響到文庫的質量。為了避免空載現象，采取大提質粒以增加載體的濃度，酶切成線性化后跑瓊脂糖凝膠電泳驗證，將完全酶切呈線性的載體進行膠回收防止污染，純化后用CIAP進行脫磷處理以防止載體自連現象，再次瓊脂糖凝膠電泳回收純化備用。

高質量的染色體基因是另一個構建完整文庫的影響因素，樹干畢赤酵母染色體的各種提取方法原理相通，僅破裂細胞方法不同，大體分為物理法和酶法。物理法有液氮研磨法和玻璃珠震蕩破碎法，這種方法由于震動劇烈會使細胞核破裂從而染色體斷裂；而酶法采用蝸牛酶破壁形成原生質體，再堿裂解細胞，相對溫和，大大減少了染色體的斷裂。染色體DNA的處理可以用物理機械剪切，也可以用限制性酶消化。機械切割法可獲得較均一的隨機片段，但片段不能直接用于克隆，需要經過末端修飾，連上接頭后再用限制性內切酶消化產生黏性末端；直接用限制酶消化的方法則可以直接產生黏性末端，大大減少了工作量。

酵母菌中能夠降解纖維二糖的菌株很少，樹干畢赤酵母是其中比較重要的一種，雖然有研究根據同源性預測了其纖維二糖酶基因信息[8]，但通過實驗無法驗證其具有活性（數據另發）。本課題研究中通過構建樹干畢赤酵母基因組文庫，以纖維二糖酶對底物纖維二糖的底物特異性篩選文庫所含基因，獲得一段P.stipitis來源的纖維二糖酶基因。該基因通過反復表達驗證，具有明顯的纖維二糖水解活性。但其堿基序列通過BLAST檢索結果均為預測序列或未知序列，未找到同源序列，三維建模也沒有成功，表明該基因是一個新基因，這為樹干畢赤酵母纖維二糖代謝機理的研究提供了一個新的切入口，具有一定的學術意義。課題組接下來將進一步對所獲得的基因進行功能和調控機理等分析，并構建高效利用纖維二糖的重組工業酒精酵母菌株。

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