酶聯免疫法檢測食品中乳酸鏈球菌素

孟 茹， 趙貴明， 賈 瑜， 王振寶

（1.伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆 伊寧 835000；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100013；3.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206）

乳酸鏈球菌素[1]（英文名Nisin，以下簡稱Nisin）又稱乳鏈菌肽，是一種高分子多肽，分子式為C143H228N42O37S7。它是從乳酸乳球菌或乳酸鏈球菌發酵產物中提制的一種多肽抗菌素類物質，被認為是一種高效、天然生物性食品防腐劑和抗菌劑，能有效殺死或抑制引起食品腐敗變質的革蘭氏陽性菌，特別是細菌孢子，如葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、小球菌、明串珠菌、芽孢桿菌等。到目前為止，全世界約有50多個國家和地區廣泛使用Nisin[2]，我國于1990年開始批準使用Nisin，并在 《GB 2760-2010食品添加劑使用衛生標準》中規定Nisin作為食品防腐劑的最大允許使用量。

Nisin定量分析的最初測定方法為甲基藍還原法[3]，后來相繼開發了用于Nisin定量的生物分析方法，包括試管稀釋法、濁度分析法[4]、瓊脂擴散法[5-7]、ATP生物發光測定法[8-9]、綠光熒光蛋白測定法和微量滴定法等。國外于1990年開始報道Nisin的酶聯免疫分析法，Falahee[10]發展了多克隆抗血清分析乳酸鏈球菌素的酶聯免疫分析法，該方法對奶酪中Nisin的最低檢測質量濃度為200 ug/mL。Suacrez[11]設計的多克隆抗體酶聯免疫吸附法在牛奶和乳清中的最低檢測質量濃度為170 ug/mL。作者從制備Nisin多克隆抗體、優化反應模式出發，建立了乳制品及肉制品中Nisin間接競爭性ELISA定量檢測方法并制備了相應的試劑盒，擴大了檢測對象范圍，具備穩定性好，檢測限低的特點，并填補了國內乳酸鏈球菌素酶聯免疫檢測試劑盒的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，購自興隆實驗動物養殖廠。

1.1.2 試劑 Nisin標準品，牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），美國Sigma公司產品；羊抗兔酶標記二抗，北京金橋凱泰生物技術有限公司產品；TMB底物顯色液，弗氏完全佐劑（羊毛脂、液體石蠟，自配），弗氏不完全佐劑（羊毛脂、液體石蠟和卡介苗，自配），其他常規化學試劑，國藥集團化學試劑北京有限公司產品。

1.1.3 設備 MK3型酶標儀，芬蘭雷伯公司產品；微量移液器，Eppendorf公司產品；BF400型恒溫培養箱，德國賓得公司產品；MK3型漩渦混合器，德國IKA公司產品；MS1602S型電子天平，梅特勒·托利多公司產品。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 采用碳二亞胺法[12]將Nisin標準品分別與BSA和OVA偶聯制備偶聯物，分別作為免疫原和包被原。

1.2.2 多克隆抗體的制備

1）動物免疫

由于Nisin的分子量為3 510 Da，而其活性分別以二聚體和四聚體形式出現，其二聚體和四聚體的分子量分別為7 000 Da和14 000 Da[13-14]，介于小分子和大分子之間，故用Nisin的標準品以及其與BSA的偶聯物分別作為免疫原進行免疫。

取1.0 μg/mL的免疫原溶液用于免疫新西蘭大白兔。首次免疫時，將免疫原與等量的弗氏佐劑混勻，每只兔子2.0 mL，頸背部皮下多點注射，每點0.2 mL，第二次免疫時取免疫原與等量的弗氏不完全佐劑混勻，每只兔子2.0 mL，頸背部皮下多點注射，每點0.2 mL。每次注射間隔2周，從第三次免疫開始，每次免疫后一周采血檢測抗血清效價，連續加強免疫，直到獲得滿意的抗體效價為止。最后一次無佐劑用1.0 mg抗原直接腹腔注射。

2）抗血清的采集

將兔子全身麻醉后實施心臟穿刺取血。將采得的血液室溫靜置2～3 h，4℃過夜后低速離心30 min分離血清，收集上清液，分裝，-20℃凍存備用。

3）抗血清的純化

采用辛酸-硫酸銨法[15-16]純化制得的多克隆抗體，用紫外-可見分光光度計測定其在280、260 nm的吸光度值，計算蛋白質含量[17]。

1.2.3 ELISA方法的建立

1）酶標板包被抗原的選擇

將Nisin-OVA偶聯物及Nisin分別稀釋至相同的濃度，包板后采用間接競爭法檢測。

2）最佳抗原抗體稀釋質量濃度配比的確定

將上步選定好的抗原和抗體分別梯度稀釋后，帶2.5 μg/mL的標準品進行檢測，確定抗原抗體的最佳稀釋倍數。

3）標準曲線的建立

通過預實驗，將標準品稀釋為 0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μg/mL 作為標準點，各取 50 μL 加入已包被有抗原的酶標板孔，然后加入50 μL按最佳稀釋倍數稀釋的抗體溶液，置于37℃避光反應30 min，取出洗板4～5次。每孔加入已經稀釋好的酶標抗體100 μL，37 ℃避光反應 30 min，取出洗板 4～5 次。加入底物顯色液100 μL后，37℃避光反應15 min，用酶標儀在450/630 nm處測定波長，建立標準曲線。

4）樣品處理方法的選擇

將肉制品剁碎成粉末狀后取樣，用稀釋液稀釋不同的倍數；含乳飲料直接稀釋不同的倍數后分別進行直接檢測和添加標準品后測定回收率。選擇樣本檢測值穩定、添加回收率準確的樣本處理方法。

1.2.4 ELISA方法的評價

1）方法的靈敏度

評價競爭ELISA方法靈敏度的指標，常用的有IC50抑制濃度 （指0標準溶液吸光度值的50%處所對應的標品濃度）和最低檢測限，兩者值越低說明試劑盒的靈敏度越高。一般規定20份空白樣品或零標準品的測定平均值加3倍標準差為方法的最低檢測限。分別測定20次標準曲線的IC50抑制濃度，確定該值浮動范圍。分別測定20份空白含乳飲料和肉制品，求其對應的最低檢測限。

2）方法的準確度和精密度

取空白肉制品樣品以 0.5、10、100 μg/g Nisin 進行添加， 取空白乳制品樣品以 1、30、300 μg/mL Nisin進行添加，每種樣品、每個質量分數或質量濃度各取5個平行，分別用不同批次制備的間接競爭ELISA試劑盒進行測定。

2 結果與分析

2.1 Nisin多克隆抗體的制備

用Nisin直接免疫的兔子得到的抗血清效價比用Nisin-BSA偶聯物免疫的兔子的抗血清效價高，說明Nisin具備免疫原性。 經過8次免疫后，采血檢測抗血清的效價達到1∶10 000。純化后的抗體用紫外分光光度計測得蛋白質質量濃度為10.66 mg/mL。

2.2 包被抗原的選定結果

取Nisin-OVA偶聯物及Nisin分別包被后的檢測結果，見表1。

從表1可見，在相同條件下，Nisin-OVA偶聯抗原包被比用Nisin直接包被測得的OD值高，且帶2 μg/mL的標準品的OD值在0標準品OD值的一半左右。因此用Nisin-OVA偶聯抗原作為包被原效果更好，這可能是因為Nisin是一種多肽，聚苯乙烯酶標板對多肽的吸附性并不好，故需要將其與大分子蛋白進行偶聯才能更好地吸附在酶標板上。

表1 不同包被原的檢測結果Table 1 Different package of the original test results

2.3 抗原與抗體最佳稀釋倍數的確定

抗原和抗體按照不同的稀釋倍數稀釋后，采用間接競爭ELISA法測得OD值，見表2。

表2 抗原抗體稀釋倍數的選定Table 2 Selected antigen-antibody dilution factor

由表2可以看出，當抗原稀釋1 000倍、抗體稀釋10 000倍時，帶2.5 μg/mL的標準品的抑制最好，綜合考慮成本以及誤差等因素，故選用抗原和抗體的最佳稀釋倍數均為10 000倍。

2.4 標準曲線的建立結果

通 過 實 驗 最 終 選 中 0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μg/mL這幾個質量濃度作為曲線中標準品的最終質量濃度。以標準品濃度的對數值（logC）為橫坐標，以吸光度值的logit值為縱坐標建立雙對數直線擬合曲線，數學模型為logit y=a+blogC。其中logit y=ln（A/（A0-A）），A0為零標準品的吸光度值，A 為其他質量濃度標準品吸光度值。建立的標準曲線見圖1，該曲線的IC50為1.1 μg/mL，曲線的相關系數為r=0.993 4。

圖1 標準曲線圖Fig.1 Standard curve

2.5 樣品前處理方法的選定

將含乳飲料用樣本稀釋液稀釋10倍，取50 mL用于分析。

將肉制品樣本剁碎成粉末狀，取1 g樣本至50 mL的離心管內，加入5 mL的樣本稀釋液，充分震蕩混勻后靜置10 min，小心地提取上清液1 mL至2 mL的離心管中用于分析，注意不要吸到表層的油脂和底層的沉淀物。取50 μL用于分析。

經驗證，上述方法處理的樣本檢測結果準確，且添加回收率正常。

2.6 方法的靈敏度

20次標準曲線的IC50測定結果見表3。

從表 3可知，IC50平均值為 1.16 μg/mL，浮動范圍在1.0～1.4 μg/mL之間。經計算IC50的平均值±3倍標準差的范圍為0.8～1.5 μg/mL；因此確定標準曲線 IC50應在 0.8 μg/mL～1.5 μg/mL 的范圍之內。

對空白含乳飲料和肉制品的最低檢測限的檢測結果見表4和表5。

表3 IC50統計表Table 3 IC50tables μg/mL

表4 空白含乳飲料測定結果統計表Table 4 Blank milk drinks determination of the results of tables μg/mL

續表4

表5 空白肉制品測定結果統計表Table 5 Blank meat products determination of the results of tables μg/mL

續表5

從表4和表5可見，空白乳制品樣品的最低檢測限為0.85 μg/mL，空白肉制品樣品的最低檢測限為 0.45 μg/mL。

2.7 方法的準確度和精密度

對樣本按不同質量濃度的標準品進行添加后，檢測得到的變異系數和添加回收率見表6和表7。

表6 含乳飲料樣品精密度及準確度的試驗Table 6 Milk beverage sample precision and accuracy test

表7 肉制品樣品精密度及準確度的試驗Table 7 Meat samples the precision and accuracy test

從表6和表7可以看出，對肉制品樣品以0.5、10、100 μg/g 3個質量分數的乳酸鏈球菌素進行添加，測定變異系數和回收率，樣品的板內變異系數為5.4%～8.9%之間，樣品的回收率在75.8%～112.4%之間；對乳制品樣品以 1、30、300 μg/mL 3 個質量濃度的Nisin進行添加，樣品板內變異系數為5.4%～8.3%之間，樣品的回收率在78.6%～117.9%之間。

綜上所述，所測樣品的板內變異系數在5.4%～8.9%之間，均小于20%，所測批內、批間的變異系數小于20%。樣品的回收率均達75.8%～117.9%之間。

4 結語

建立了一種快速、簡便的檢測Nisin的方法——間接競爭酶聯免疫吸附法。該方法利用預先包被在酶標板孔上的抗原（Nisin-OVA偶聯物）和樣本中的Nisin和抗體（抗Nisin多克隆抗體）競爭性的結合原理，用酶標二抗（羊抗兔抗抗體）與已經結合的抗原抗體結合物反應，進行Nisin的檢測分析。利用結合的酶標記物使無色的底物產生顏色深淺，以進行定性或定量檢測。該方法穩定性、重復性好，其檢測低限為:牛奶、飲料、乳制品為1.0 mg/L（mg/kg）；肉制品為 0.5 mg/kg，檢測范圍 0.5～600 mg/kg（mg/L）之間。用該方法制備的試劑盒經穩定性試驗驗證，在4℃環境下可穩定6個月以上，達到應用要求。

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