適應性進化策略強化厭氧產氫菌群的發酵效能

黃振興 ， 余曉斌 ， 廖家林 ， 阮文權

（1.江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

厭氧發酵細菌由于缺乏完整的電子傳遞體系，代謝過程中底物脫氫產生的電子需要有適當的途徑進行宣泄，以維持胞內的氧化還原平衡，從而保證代謝過程的順利進行。通過氫化酶的作用，以鐵氧還蛋白作為電子載體，催化質子接受電子產生分子氫，可以作為宣泄電子和維持胞內氧化還原平衡的一種調節機制[1]。厭氧混合菌群中同時存在著產甲烷菌等耗氫微生物，因此目前大多數研究采用熱處理等方式以殺死混合菌群中的耗氫微生物，同時保留以芽孢形式存在的梭菌屬產氫發酵細菌[2]。梭菌屬產氫發酵細菌有著較高的氫氣產率，氫分子形成不僅可以基于丙酮酸脫羧作用 （pyruvateferredoxin oxidoreductase PFOR），而且可以來自于NADH的氧化 （NADH-ferredoxin oxidoreductase，NFOR）[3]。研究表明，在梭菌產氫代謝過程中，氫氣的產率取決于丁酸和乙酸的生成水平，而醇類和乳酸的積累會導致較低的氫產率。然而，丁酸的積累會反饋抑制產氫產酸過程，某些梭菌由于缺乏足夠的耐受能力，就會停止代謝或者轉換代謝途徑生成醇類或者乳酸[4]。但是不同梭菌的生理生化行為存在差異，其各自的耐受閾值和響應機制不盡相同[5]。因此厭氧菌群的微生物多樣性和基因型的不確定性會形成其內在的異質性，在產氫過程中就會形成“短板效應”，從而限制了菌群整體的發酵能力。因此如能消除混合菌群中對丁酸敏感以及富集具有較好丁酸耐受能力的產氫梭菌，消除“短板效應”，提高菌群整體水平的丁酸耐受力和持續生產力，定能強化混合菌群的發酵制氫能力。

本課題研究中以外源丁酸脅迫結合競爭性途徑抑制劑作為復合選擇性壓力，在連續流中對產氫發酵菌群進行適應性進化，在提高菌群整體耐酸水平的同時，弱化產氫競爭途徑，強化菌群整體水平的產氫能力，并在關鍵酶學水平對進化機制進行闡釋。

1 材料與方法

1.1 接種物來源及培養基成分

混合菌群取自于蘇州潔凈公司厭氧消化系統中的厭氧污泥。污泥的TS為13.24%，VS為86.46%。將厭氧污泥在100℃下干熱滅菌1 h，這樣可以完全殺死污泥里的產甲烷菌和其它細菌的營養細胞，并能保留芽孢形式的產氫梭菌。經過熱處理的厭氧污泥即為本實驗的接種物。培養基中，葡萄糖為唯一碳源，NH4Cl為唯一氮源，添加KH2PO4和 FeCl2·4H2O， 使 m （Glucose）∶m （NH4Cl） ∶m（KH2PO4）∶m（FeCl2·4H2O）=100∶5∶1∶0.3，其它微量營養成分質量濃度（mg/L）:MgSO4·7H2O 200；NaCl 20；CaCl2·2H2O 10；L-cysteine 10；Na2MoO4·4H2O 0.5；MnSO4·7H2O 0.5；H3BO30.5；ZnCl20.5；CuCl20.5；CoCl2·2H2O 0.5；Biotin 0.05；Riboflavin 0.05；Nicotinic acid 0.05。

1.2 連續流中厭氧產氫菌群的適應性進化

將經過熱處理的厭氧污泥接種至含有4 L培養基的厭氧發酵罐（7 L容量）。通入N25 min后，反應器首先在分批模式下啟動，初始接種量和葡萄糖含量分別為4.0 g/L和5.0 g/L。定時檢測產氫情況，當氫氣順利生成后啟動連續流。反應器攪拌速度為150 r/min，溫度控制在35℃。pH采用6 mol/L KOH控制在5.6。水力停留時間（HRT）最終維持在8 h（Phase I）。在穩定運行的反應器中引入外源丁酸脅迫作為選擇性壓力，并在反應器達到穩態的基礎上逐步增加質量濃度，最終脅迫質量濃度為25 g/L（Phase II）。然后逐步提高進水葡萄糖質量濃度直到底物除去率低于80%（Phase III）。最后在進化體系中引入4-甲基吡唑（醇脫氫酶抑制劑）以及草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑），形成復合脅迫壓力。

1.3 污泥細胞提取物、透性化細胞及總DNA制備

收集60 mL污泥混合液洗滌、離心，然后懸浮于3 mL含有10 mmol/L二硫蘇糖醇 （DTT）的0.1 mol/L Tris/MES（pH 7.2）緩沖液。將污泥懸浮液置Tissuelyzer II破碎儀破細胞，然后4℃下40 000 g離心30 min以去除細胞碎片和污泥雜質，上清液即為污泥細胞提取物。污泥透性化細胞制備按照O’sullivan和Condon提出的方法并做少許修改[6]。污泥懸浮液加入體積分數10%甲苯，并在液氮中凍融兩次。污泥總DNA的提取采用Mobio公司的PowerSoil DNA isolation kit試劑盒，并按照說明書操作。

1.4 氫化 酶 （hydrogenase）、NFOR、 膜 ATPase（membrane ATPase）活性測定

Membrane ATPase活性測定反應體系 （1 mL）:50 mmol/L Tris-maleate，10 mmol/L MgSO4，0.2 mol/L ATP，100 μL透性細胞懸浮液。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol磷酸根離子所需要的酶量。

NADH-ferredoxin oxidoreductase（NFOR）活性測定反應體系（1 mL）:50 mmol/L Tris-MES；2 mmol/L DTT；7 mmol/LMNADH；4 mmol/L acetyl-CoA； 2 mmol/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）；101 325 Pa CO； 10 μmol/L FAD； 200 μL 細胞提取物。酶活定義為每分鐘生成1 μmol TF所需要的酶量。

Ferredoxin-NAD+oxidoreductase（FNOR）活性測定反應體系（1 mL）:50 mmol/L Tris-MES， 2 mmol/L甲基紫晶，60 mmol/L亞硫酸鈉，5 mmol/L NAD+，101 325 Pa CO， 10 mmol/L DTT， 200 μL cell extract。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol NADH所需要的酶量。

Hydrogenase活性測定反應體系 （1 mL）:50 mmol/L Tris-MES，2 mmol/L甲基紫精，60 mmol/L亞硫酸氫鈉，100 μL細胞提取物。酶活定義為每分鐘釋放1 μmol氫氣所需要的酶量。

1.5 PCR-DGGE表征進化過程中微生物群落的動態變化

采用細菌通用引物F341與R534對污泥總DNA進行擴增，其中引物F341的5’端帶有GC夾[7]；PCR反應采用25 μL的反應體系，擴增條件為:94℃預變性 4 min，94℃變性 1 min，65℃退火 1 min，之后每個循環降低0.5℃，72℃延伸1 min，20個循環，然后再以94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行10個循環，最后72℃終延伸6 min。PCR產物用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。采用突變凝膠電泳（DGGE）對擴增產物進行分離，用SYBR Green I染色后拍照觀察。將DGGE指紋圖譜與發酵參數結合分析群落進化過程。

1.6 分析方法

污泥生物量以揮發性懸浮物（VSS）計，按照國標法測定；葡萄糖含量利用生物傳感器測定；氣相產物采用氣相色譜儀測定；液相產物采用液相色譜儀測定；TF采用分光光度計測定；NADH含量采用酶法進行測定[8]；磷酸根離子含量采用多參數水質分析儀測定，發酵液總碳含量用TOC測定儀測定。

2 結果與討論

2.1 在連續流中，以丁酸作為選擇性壓力對厭氧污泥進行適應性進化

如圖1所示，和已有研究結果一致，厭氧菌群在低負荷（Phase I）運行條件下，液相產物主要為丁酸和乙酸，兩者碳含量占液相產物總碳的90%以上。DGGE圖譜分析表明，此時的微生物多樣性顯著。在此基礎上逐漸引入外源丁酸脅迫，脅迫終質量濃度為25 g/L（Phase II）。在此穩態基礎上的DGGE分析表明微生物多樣性顯著降低，說明一些酸敏感微生物由于缺乏足夠的酸耐受能力，其生長受到抑制，在連續流中被淘汰出反應器或者喪失了其生長優勢。但是代謝產物分析表明，丁酸脅迫在低負荷下并沒有誘導醇類等競爭性產物生成，反應器中的代謝產物主要還是丁酸和乙酸。這可能是因為梭菌產醇或者產乳酸途徑的引發需要足夠ATP庫或者較高的底物濃度[4]。因此，在外源丁酸脅迫的基礎上，逐漸提高培養基中的葡萄糖質量濃度，直到底物降解率下降到80%以下，其目的在于充分激發某些梭菌以產醇途徑的轉化來應對丁酸脅迫的可能性（Phase III）。在此條件下反應器達到穩態后，發現有大量的丁醇、乙醇和乳酸生成，這說明某些梭菌在低負荷下可以依賴自身一定的耐酸機制來抵御酸脅迫，但是高負荷下其又通過產醇和產乳酸途徑的轉換來響應。這種現象會造成高負荷下產氫過程的短板效應，從而限制了厭氧菌群的產氫能力。同時DGGE結果表明，當有機負荷提高以后，微生物的多樣性有所增加。這可能是由于在丁酸脅迫壓力和低負荷條件下，某些梭菌由于缺乏足夠的耐酸能力，其生長能力在厭氧菌群中處于劣勢但是并沒有完全淘汰出反應器，當有機負荷提高后，其又可通過產醇或者產乳酸來抵御丁酸脅迫并恢復其生長優勢，從而展現在DGGE圖譜中。為了消除以上存在的不利現象，在進化過程中繼續引入（醇脫氫酶抑制劑）以及草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑）來抑制產醇和產乳酸途徑，兩種抑制劑的最終濃度為12 mmol/L和20 mmol/L。當反應器達到穩態后（Phase IV），分析發現，乙醇、丁醇以及乳酸生成受到明顯抑制，乙酸和丁酸再次成為主要的代謝產物。此階段的DGGE指紋分析表明，微生物的多樣性大幅降低，只存在3種較為明顯的條帶。這是因為在高負荷下那些依賴代謝途徑轉化來抵御丁酸脅迫的梭菌，由于其響應策略受到化學抑制劑的阻礙而無法進行，這時其胞內的pH動態平衡或者氧化還原平衡將被打破，其生長能力受到嚴重抑制，從而在連續流中被淘汰出反應器。通過以上的適應性進化過程，具有較強丁酸脅迫耐受力，且是不依賴于代謝途徑轉換的產氫菌可以在反應器中得到富集。

圖1 適應性進化過程中代謝產物的碳分布以及微生物群落的演替Fig.1 Carbon distribution and bacterial community succession during the adaptive evolution

2.2 適應性進化策略對厭氧產氫的強化作用

為了驗證適應性進化策略對產氫發酵的作用，本課題研究中分別對原污泥和進化污泥在高濃度有機物條件下的產氫潛力進行研究。兩種污泥的發酵產物含量變化如圖2所示。隨著時間變化，產物含量越來越高，32 h之后葡萄糖含量都在200 mg/L以下，降解率都接近于100%。碳平衡都達到98%以上，說明沒有重要的產物測定遺漏。由圖2（b）可見，在原污泥的發酵過程中，4 h的時候開始出現醇類產物，此時有機酸含量為0.88 g/L（12.6 mmol/L）。發酵結束時，總的醇類產量為6.49 g/L，主要包括乙醇（3.05 g/L），丁醇（2.48 g/L）和丙酮（0.96 g/L），沒有乳酸的生成；同時總酸的產量為7.07 g/L，包括丁酸（50.0 mmol/L）和乙酸（44.5 mmol/L）。 由于醇類積累，氫氣產率和產生速率分別僅1.43 mol-H2/mol-Glucose 和 0.168 L/（L·h）。 相比較的是在進化污泥的發酵過程（圖2（a））中，氫氣產率和生成速率增加了56.5%，分別達到了2.25 mol-H2/mol-Glucose和0.263 L/（L·h），乙酸/丁酸增加到了 1.33，丁酸和乙酸產量分別達83.3 mmol/L和111.2 mmol/L。此外，進化污泥的發酵過程中出現了少量琥珀酸，意味著在厭氧菌群的進化過程中可能有新的代謝途徑得到了誘導。最近研究表明，一些厭氧菌特別是一些梭菌屬的微生物具有分支的TCA循環。這樣的TCA循環一方面可以提供谷氨酸等氨基酸合成的前體物質，充足的氨基酸庫有助于一些氨基酸依賴型耐酸系統的運行[9]；另一方面依賴分支TCA循環，琥珀酸可以在一些脅迫環境下正向或者反向合成，這對細胞保持NAD+/NADH平衡起到一定的作用[10]。因此在進化污泥的發酵過程中琥珀酸的形成，一方面可能是因為進化污泥中氨基酸依賴型耐酸系統的誘導而形成，另一方面也可能是由于耐丁酸微生物為了保持自身的NAD+/NADH平衡而形成的一種輔助調節機制。

圖2 進化污泥和原污泥的發酵性能比較Fig.2 Comparison of fermentation performances between evolved cultures and original cultures at a high initial glucose concentration of 30 g/L

2.3 進化機制在酶學水平的解析

以上結果表明，進化污泥和原污泥在高有機負荷下的代謝表現存在明顯差異。為了闡釋其內在差異，作者對產氫和耐酸性相關酶學水平的表現進行了研究，以解析其進化機制。將原污泥與進化污泥分別接種至發酵罐中，反應條件參照2.2節。在發酵產氫過程的指數期取樣測定。結果發現，兩種產氫菌群在酶學水平上存在著顯著差異。如圖3所示，在進化污泥中，氫化酶、Membrane ATPase以及NFOR的比酶活分別為260 U/g，200 U/g及36 U/g，而原始污泥中其比酶活僅分別為128 U/g，126 U/g以及29 U/g。Membrane ATPase是微生物主要的耐酸機制之一，其高活性說明進化污泥有著較好的耐酸潛力以保證其在高負荷下丁酸和乙酸的持續生成。此外，丁酸和乙酸的生成過程中，其產生的電子需要及時得到宣泄，而進化污泥產醇和產乳酸途徑的削弱，電子則主要依賴釋氫作用宣泄，因此氫化酶和NFOR的高活性可以保證負荷提升之后的高產氫效率。原污泥中的某些梭菌由于相對低的耐酸能力和釋氫活性，其不僅造成了菌群整體水平的活性降低，而且當負荷提高之后，耐受機制無法應對發酵過程中產生的酸脅迫，就會通過代謝途徑轉化來維持代謝活性，從而在產氫過程中導致短板效應，氫氣產率大大降低。但是在進化污泥和原始污泥中都存在著相當的FNOR活性。

圖3 產氫和耐酸性相關酶活水平的比較Fig.3 Comparison of enzymatic activity involved in H2 and acid tolerance

FNOR是產醇途徑中代表性的一種酶，其與NFOR分別催化電子在鐵氧還蛋白和NAD+之間的相互傳遞，如公式 （1）所示。但是基于NFOR的NADH氧化產氫熱力學上是不可行的，其已被證實可以被丁酸合成途徑中巴豆酰輔酶A的還原放能反應所驅動，在梭菌中此耦合反應由丁酰輔酶A脫氫酶復合物（ETF/BCD）所介導，如公式（2）所示[11-12]。因此NFOR與FNOR很有可能是一種鐵氧還蛋白氧化還原酶催化的正逆反應，只是其反應過程并不一致。NFOR需要ETF/BCD介導的放能反應驅動，其測定過程必須要加入乙酰輔酶A或者巴豆酰輔酶A，所以此方向的活性很大程度上取決于丁酸合成途徑的活性。而在FNOR反應方向下不需要任何其它反應參與，所以比酶活取決于細胞提取物中酶本身的含量和催化活性。以上分析說明，此酶的反應方向或活性取決于丁酸合成活性，反過來說丁酸積累不僅會導致酸脅迫效應，而且會反饋抑制基于NFOR的NADH氧化，從而造成NAD+再生壓力。這也很好地解釋了為什么是丁酸而不是乙酸、乳酸等其它有機酸能夠激活產醇等競爭性途徑。

3 結語

1）在連續流中，通過適應性進化手段，消除了厭氧菌群中對丁酸敏感以及依賴代謝途徑轉換來抵御丁酸脅迫的產氫梭菌，有效抑制了產氫菌群整體水平上的代謝異質性，從而顯著弱化了產氫菌群在發酵過程中的短板效應。

2）相較于原始污泥，進化污泥在利用高濃度底物產氫過程中競爭性途徑活性大大減弱，而丁酸和乙酸的持續生成力更強，從而獲得了較高的氫氣產率。

3）耐酸機制和產氫作用相關酶活分析表明，較于原始污泥，進化污泥的Membrane ATPase、氫化酶以及NFOR活性更強，其保證了在高負荷下厭氧菌群氫氣、乙酸以及丁酸的持續生產力。

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