環丙烯類乙烯效應抑制劑二次處理對番茄乙烯生成及其基因表達的影響

程順昌， 徐方旭 ， 付 琳， 魏寶東， 冷俊穎， 馮敘橋 *，2

（1.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽110866；2.渤海大學 食品科學研究院，遼寧 錦州 121013）

1-MCP是一種有效的乙烯作用抑制劑，能夠在一定貯藏期內，去除乙烯對貯藏果實的作用[1]。1-MCP抑制乙烯效應的作用，被認為是與乙烯受體結合而阻斷了乙烯調控的生理生化過程，在眾多的研究中發現，經1-MCP處理后的果實能夠完成正常的成熟過程，只是成熟進程受到了延遲。因此，對于1-MCP延緩果實成熟作用機理的解釋可能是以下情況之一:一種情況是1-MCP處理后經過一段時間，1-MCP從乙烯作用受體上脫落，最終乙烯再與其受體結合，從而完成其成熟過程；還可能是由于有新的乙烯受體合成，繼而與乙烯結合，完成成熟過程[2-3]。

近年來，又發現1-MCP的結構相似物，也有延緩果蔬成熟衰老的作用，但對其作用機理的研究較少[4-5]。

番茄（Solanum lycopersicum L.）屬于呼吸躍變型果實，采收后仍然進行著生命活動，表現出明顯的色澤、硬度、糖酸含量和成熟衰老等變化，是進行果蔬采后生理學研究理想的模式材料。1-MCP和1-PentCP和1-OCP等環丙烯類屬于乙烯作用抑制劑，被認為是影響了乙烯與受體的結合過程，從而影響乙烯效應的發揮。本研究中以番茄為試材，采用1-MCP及其結構相似物中相互間分子量差異較大的兩種化合物1-PentCP和1-OCP，采用二次處理的方式處理番茄果實，對其常溫貯藏期間的乙烯生物生成及關鍵基因表達進行了研究，以探究環丙烯類乙烯作用抑制劑的作用機理，比較不同側鏈長度對果蔬成熟衰老進程的影響。期望為探究1-甲基環丙烯類保鮮劑的作用機理和篩選適宜的果蔬保鮮劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗用番茄果實于2011年9月30日采自沈陽市蘇家屯王崗鄉一長勢良好的菜地，手工采摘后裝入紙箱中立即運回實驗室，剔除殘次、病蟲、機械傷害果后，挑選成熟度為綠熟期，質量、大小和顏色均勻一致的果實進行試驗處理。

1.1.2 處理材料 1-MCP粉劑，由中國農科院果樹所 提 供 （3.4%含 量 分 數 ）。1-PentCP （1-pentylcclopropene，1-戊基環丙烯） 和 1-OCP （1-octylcyclopropene，1-辛基環丙烯），主要參照 Al Dulayymi[6-7]的方法，在沈陽農業大學食品學院實驗室合成，質量分數30%，樣品被分裝成0.5 mL的小包裝，保藏于-80℃超低溫冰箱中備用，使用前用乙醚稀釋至50 mL，同樣濃度的乙醚通過實驗排除了對番茄果實可能產生的生理效應。

1.2 處理方法

將挑選的果實隨機分為4組，每組約50個果，將果實分別放入1 m3的塑料帳內，分別進行以下處理:

1）1-MCP處理，參照孫希生[8]的方法，稱取質量分數3.4%的1-MCP粉劑，放入開放的培養皿中，按質量比1∶16加入40℃溫水，迅速封閉塑料帳，1-MCP體積分數為0.75 μL/L；

2）1-PentCP處理，取1-PentCP的乙醚溶液1.13 mL滴于濾紙上，置于塑料帳內，迅速封閉塑料帳，1-PentCP 體積分數為 0.5 μL/L；

3）1-OCP處理，取1-OCP的乙醚溶液3.3 mL，滴于濾紙上，置于塑料帳內，迅速封閉塑料帳，1-OCP體積分數為 2 μL/L；

4）對照（CT），果實不采用任何處理，密封于塑料帳內。各處理在20℃下密封20 h后，裝入0.02 mm保鮮袋 （國家農產品保鮮工程研究中心生產的果蔬專用保鮮袋）中，于20℃下貯藏，貯藏第9天，4個處理分別進行第二次處理，方法同第一次處理的方法，定期測定相應指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 呼吸強度與乙烯釋放量的測定 取6個果稱重后置于4.6 L的真空干燥器內，分別在果實放進干燥器開始和放置1 h后測定干燥器中的CO2濃度 （PBI Dansensor CheckPoint O2/CO2測定儀，丹麥），計算公式如下:

呼吸強度 （mg/（kg·h））=CO2濃度變化差×44×（干燥器的體積-果實體積）/22.4/果實質量/1 000

乙烯測定方法與呼吸強度測定相同，果實在干燥器內密閉1 h后，用注射器抽取1 mL樣氣用氣相色譜儀（CP-3800，美國，瓦里安公司）測定乙烯釋放量。色譜條件:FID檢測器，柱溫60℃，檢測器溫度270℃；N2體積流量 4.0 mL/min，重復3次，取平均值。外標法定量。以下述公式計算乙烯釋放量:

乙烯釋放量 （μL/（kg·h））=乙烯濃度×（罐子體積-果實體積）/2/果實質量/1 000

1.3.2 RNA提取及ACO1和ACS2基因表達檢測參照楊亮等[9]的方法，采用改進的異硫氰酸胍法提取總RNA，提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用紫外分光光度計測定總RNA純度。RNA反轉錄:采用購自天根生化科技（北京）有限公司（Tiangen Biotech（北京）Co.，Ltd）的反轉錄試劑盒，合成cDNA第一鏈，引物為Oligo（dT）。反轉錄產物PCR擴增:根據Genbank已收錄的番茄ACS和ACO家族基因序列設計引物，進行PCR擴增。以凝膠電泳和成像表征不同處理對ACS2和ACO1表達的影響。 引物分別為 ACS2-F:5’-GCGCAACAATGGAAGAAGAATA-3’，ACS2-R:5’-GACAACTGGTCTATGTACTTAGACAT-3’ ；ACO1-F:5’ -CAGAGGTTTAAGGAACTAGTGGCA-3’，ACO1-R:5’ -GATATTAGAAGTAGGAAGATGGCG-3’。

1.3.3 果實色度的測定 用CR-400型色差計 （日本柯尼卡美能達）測果實的L、a、b值，L代表亮度（數值 0-100）；a 代表顏色變化（數值-60～60，從綠到紅）；b 代表顏色變化（-60～60，從藍到黃）[10]。

1.3.4 硬度測定 用便攜式果實硬度計測定（探頭直徑 5 mm， 測定深度 10 mm，FT-327，Fruit TestTM意大利），單果重復4次，每次測定3個果，取平均值。

1.3.5 可溶性固形物測定 采用WYT-1型 （上海精密儀器儀表公司）手持折光儀測定。

1.3.6 可滴定酸含量測定 采用酸堿滴定法進行測定，單位為每100 g樣品中酸的質量（%）。

1.4 統計分析

試驗數據采用 Excel進行數據計算并作圖，SPSS“one-way ANOVA”進行差異顯著性分析。p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實呼吸強度和乙烯生成量的影響

2.1.1 不同處理對番茄果實呼吸強度的影響 番茄屬于典型的呼吸躍變型果實。從圖1中可以看出，對照和處理果實采收時呼吸強度較高，之后迅速下降，之后緩慢上升，最后又下降，呈現波動的趨勢。

圖1 不同處理對番茄果實呼吸強度的影響Fig.1 Effect of treatments with 1-MCP or its structural analogues on respiration intensity

對照果實在第14天達到呼吸高峰，1-MCP處理果實在第22天出現呼吸高峰，而1-PentCP和1-OCP處理果實的呼吸高峰出現在第16天。因此不同處理均不同程度地延遲了呼吸高峰出現的時間，抑制了呼吸高峰的峰值，其中以1-MCP處理效果最好。

2.1.2 不同處理對番茄果實中乙烯釋放量的影響1-MCP類乙烯抑制劑能夠與乙烯競爭作用位點，因而能夠抑制乙烯的生理作用。從圖2可以看出，番茄果實在采后貯藏前期乙烯生成量很少，在貯藏的后期生成量升高，達到一定峰值后，生成量又下降至初始水平。

圖2 不同處理對番茄果實乙烯釋放量的影響Fig.2 Effect of treatments with 1-MCP or its structural analogues on ethylene production

貯藏第18天時，對照果乙烯釋放量達到71.70 μL/（kg·h），1-MCP 處理果乙烯釋放量為 3 3.48 μL/（kg·h），1-PentCP 處 理和 1-OCP 處 理果 實 乙 烯 釋 放 量 分 別 為 48.90 μL/（kg·h） 和61.70 μL/（kg·h）。 各處理均能不同程度地抑制乙烯釋放量，其中1-MCP抑制效果最佳。

2.2 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實貯藏期間乙烯合成關鍵基因表達的影響

2.2.1 不同處理對番茄果實中ACS2基因表達的影響 圖3表明，在貯藏過程中，ACS2基因的表達量逐漸增大。

圖3 不同處理對番茄果實中ACS2基因表達的影響Fig.3 Effect of treatment with 1-MCP or its structural analogues on ACS2 gene expression in tomato fruits

貯藏第4天，對照果和各處理番茄果實中ACS2基因的表達微乎其微，對照果的表達量較多。貯藏第8天，1-MCP和1-PentCP處理果不同程度地抑制ACS2基因的表達，而1-OCP處理效果不明顯，其中1-MCP處理果效果最明顯。貯藏第12天，各個處理果實中ACS2基因表達增加，處理間差異不大。結果說明，1-MCP處理和1-PentCP處理可以抑制番茄果實成熟過程中ACS2基因的表達，從而影響番茄果實的成熟衰老進程。其中以1-MCP處理效果最好，1-OCP處理效果不明顯。

2.2.2 不同處理對番茄果實中ACO1基因表達的影響 綠熟期番茄在采后初期，ACO1基因表達處于較低水平，隨著果實的成熟，ACO1繼續積累，積累到最高點后，隨著乙烯生成量的上升而快速降低。從圖4可以看出，隨著貯藏天數的增加，各處理的番茄果實中ACO1基因表達量逐漸增大。

圖4 1-MCP及其結構相似物二次處理對番茄果實中ACO1基因表達的影響Fig.4 Effect of treatment with 1-MCP or its structural analoguesonACO1geneexpressionsintomatofruits

貯藏第4天，對照和處理番茄果實中ACO1基因表達都很弱；貯藏第8天，1-MCP處理抑制了ACO1基因的表達，1-PentCP和 1-OCP處理對ACO1基因表達影響不大；貯藏第12天時，各個處理果實中ACO1基因表達明顯增加，其中對照果的表達最強，1-MCP及其結構相似物處理不同程度抑制了ACO1基因的表達。

2.3 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實貯藏期間品質的影響

2.3.1 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實色度的影響 轉色期的番茄果實在貯藏過程中果實顏色逐漸由綠色轉為紅色，因此色度中b值逐漸增大，環丙烯類乙烯作用抑制劑處理，不同程度地抑制了番茄果實轉色的進程，在貯藏第8-12天時，各處理均顯著抑制了果實的轉色（圖5）。

圖5 不同處理對番茄果實色度的影響Fig.5 Effect of treatments with 1-MCP or its structural analogues on ACS activity

其中1-MCP處理差異極顯著，但在第20天時，1-MCP處理果實轉色不充分，還呈現較多的綠色，與對照和其他兩個處理果實的色度差異極顯著，而1-PentCP和1-OCP處理與對照果實的色度差異不顯著。因此環丙烯類抑制劑可以較明顯地抑制番茄果實貯藏過程中顏色的變化，其中以1-MCP處理效果最好。

2.3.2 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實硬度的影響 由圖6可看出，在常溫貯藏條件下，隨著貯藏天數的增加，各處理番茄果實硬度均呈不斷下降趨勢。

對照果實的硬度下降的程度略大于個處理果實。貯藏中期，1-MCP處理果實硬度下降平緩，1-PentCP和1-OCP處理果實軟化進程較快于1-MCP處理。但各處理果實軟化速度和程度均低于對照果，其中1-MCP處理效果較好。

圖6 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實硬度的影響Fig.6 Effect of treatment with 1-MCP or its structural analogues on firmness of tomato fruits

2.3.3 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實可溶性固形物含量的影響 從圖7中可看出，對照果的可溶性固形物（SSC）含量變化趨勢是先上升后下降，而各處理果實中可溶性固形物含量一直處于緩慢上升的趨勢。

圖7 1-MCP及其結構相似物二次處理對番茄果實中可溶性固形物含量的影響Fig.7 Effect of treatment with 1-MCP or its structural analogues on SSC of tomato fruits

整個貯藏期，1-MCP處理、1-PentCP和1-OCP處理果實SSC含量上升速度和對照果差異不大，并且各處理果中SSC含量雖低些，但是相差不明顯。由此表明，各處理對番茄果實中可溶性固形物含量的影響很小。

2.3.4 1-MCP及其相似物二次處理對番茄果實可滴定酸含量的影響 從圖8中看出，番茄果實中可滴定酸含量在貯藏過程中總體呈現下降的趨勢。

1-MCP及其結構相似物處理均不同程度地抑制了果實貯藏過程中可滴定酸含量的下降速度，即處理后果實中可滴定酸含量在整個貯藏過程中的含量高于對照果實，其中以1-MCP處理抑制作用最為明顯。但貯藏末期，處理果與對照果實中可滴定酸含量之間差異不顯著。由此表明，1-MCP及其結構相似物處理對番茄果實貯藏后期的品質影響不大。

圖8 1-MCP及其結構相似物二次處理對番茄果實中可滴定酸含量的影響Fig.8 Effect of treatment with 1-MCP or its structural analogues on Titratable acidity content of tomato fruits

3 討論

研究發現，1-MCP、1-PentCP和1-OCP處理能不同程度地抑制寒富蘋果和番茄果實采后貯藏過程中的呼吸強度和乙烯生成量[11-12]；進一步的研究發現，3種乙烯抑制劑主要是通過抑制番茄果實中ACS2和ACO1基因的的表達而實現的，而且對基因表達的抑制程度與對果實成熟衰老的影響程度相一致，即抑制表達越明顯，果實成熟衰老進程出現越晚，品質保持時間越長。

環丙烯類化合物主要通過競爭性結合乙烯受體，而使乙烯無法完成正常的生理效應。而這種結合受乙烯受體和環丙烯類化合物的空間位置，誘導效應和雙鍵與甲基位置等因素的影響。1-MCP，1-PentCP和1-OCP是分別具有1，5，8個碳的支鏈的環丙烯類物質。本試驗研究發現，不同乙烯抑制劑處理后對果實呼吸強度和乙烯生成量具有明顯的抑制作用，利于保持果實細胞膜完整性，延緩果實成熟衰老進程。 其中以 1-MCP（0.75 μL/L）和 1-PentCP（2 μL/L）的效果較好，1-OCP 處理效果不明顯。這與項目組前期的研究結果相一致[11-13]，而Sisler等人對香蕉研究發現，1-位碳鏈長度的增長利于提高環丙烯類化合物抑制乙烯的效應，支鏈長度在5個碳以上的環丙烯類抑制劑，其最小抑制濃度也較小，隨著支鏈碳鏈長度的延長，其化合物在香蕉常溫貯藏中表現出了更好的保鮮效果[14]。本研究中，1-OCP處理效果不明顯的主要原因可能是由于 1-OCP處理的體積分數較低 （0.5 μL/L）；Sisler等人研究發現，1-OCP處理香蕉和康乃馨花的保鮮效果比1-MCP和1-PentCP處理效果好的前提是1-OCP濃度和1-MCP處理的濃度相同或較低[15]。

1-MCP處理對果實的保鮮作用，會隨著貯藏時間延長，果實依然可以完成后熟過程，僅僅是延緩了果實的后熟進程；采用環丙烯類乙烯作用抑制劑二次處理能有效延緩果實后熟和乙烯生物合成關鍵酶基因的表達，但第二次處理效果并不明顯，這可能處理時間較長有關；陳金印等研究發現，處理12 h的獼猴桃中，1-MCP二次處理與一次處理有一定的差異，但處理24 h的，二次處理與一次處理效果差異不大[16]。

4 結語

綜上所述，3種乙烯抑制劑 （1-PentCP、1-OCP和1-MCP）在番茄果實的貯藏保鮮中具有抑制生理代謝、保持細胞結構完整性等積極作用；1-MCP類乙烯作用抑制劑可能主要是通過抑制番茄果實中ACS和ACO基因的表達而實現的。其中尤以1-MCP（0.75 μL/L）和 1-PentCP（2 μL/L）處理效果較為明顯。

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