啤酒發酵過程中影響蛋白酶A分泌的因素

宋 群 ， 劉春鳳 ， 李永仙 ， 王金晶 ， 李 崎 *

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

純生啤酒摒棄了傳統的熱殺菌工藝，因此避免了加熱對啤酒風味和營養造成的破壞，由于其良好的口感和較高的營養價值，越來越受到市場的歡迎。但是，目前國內生產的純生啤酒泡沫穩定性普遍較差，嚴重影響了純生啤酒的質量，成為制約純生啤酒發展的重要因素[1-4]。研究證實，在啤酒釀造過程中，酵母分泌的蛋白酶A是影響啤酒泡沫穩定性的關鍵因素[5-9]。研究發現，當酵母自溶時蛋白酶A會被釋放到胞外；同時，在營養物缺乏等惡劣環境下，酵母蛋白酶分選因子失效，蛋白酶A通過缺省途徑運輸到胞外[6，10]。由于純生啤酒未經過加熱處理，在貨架期內，被分泌到胞外的蛋白酶A會不斷降解啤酒中的泡沫活性蛋白，從而對純生啤酒的泡沫穩定性造成嚴重影響。隨著“純生熱”的不斷升溫，如何降低酵母分泌的蛋白酶A對啤酒泡沫產生的負面影響引起越來越多研究者的關注。Slaughter[12]等認為無顯著抑制劑存在時，發酵期間蛋白酶A活力下降，Omrod[12]、Muldbjerg發現在冷貯期蛋白酶A分泌較多。Kondo[14]發現三倍體和多倍體酵母菌株比單倍體和二倍體酵母菌株的蛋白酶A分泌量多；酵母細胞內pH不同，蛋白酶A分泌量也不同，pH越高，蛋白酶A分泌量越低；酵母貯存時間越長，貯存溫度越高，后酵過程中酵母活力越低，蛋白酶A分泌量越多；在低氮條件下，蛋白酶A的分泌量多于氮源充足時的分泌量。

作者從菌種、酵母生理狀態、酵母代數、麥汁濃度、發酵過程等方面研究了在發酵過程中影響蛋白酶A分泌的因素。結果發現，蛋白酶A分泌量高的菌株，處于穩定期之后的酵母、較高的酵母代數、較高的原麥汁濃度和在發酵階段末期都會導致發酵液中蛋白酶A活性偏高，在實際生產中可根據以上結論做出相應調整，從而減少蛋白酶A分泌，提高純生啤酒泡沫穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母菌株:G-03（F25）、D-4、C-03、青②（F15）、Q-05A、J-1為作者所在實驗室保藏；干酪素、三氯乙酸、甘氨酸、NaOH、HCl等均為分析純，上海國藥集團化學試劑公司。

熒光分光光度計（650-60）:日本 HITACHI公司；單光束紫外/可見分光光度計（UV1102）:上海天美科學儀器有限公司；精密pH計（FE20）:梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母擴培及啤酒發酵 從斜面上挑取一環酵母細胞接種到裝有10 mL麥汁的試管中，25℃培養36 h。取1 mL上述發酵液接種到裝有9 mL麥汁的試管中，25℃培養36 h。將試管中的10 mL發酵液全部轉移到裝有70 mL的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/m，搖瓶培養24 h。將三角瓶在4℃下放置12 h，使酵母泥沉降。將酵母泥接種到裝有300 mL麥汁的500 mL三角瓶中，裝上發酵栓，11℃發酵6 d。

1.2.2 主要試劑的配制

1）酪蛋白溶液（0.1%）:0.25 g酪蛋白用60 mL、6 mol/L HCl加熱、超聲溶解，加Gly-HCl緩沖液，使其終濃度為0.1 mol/L，用飽和NaOH溶液調節至pH 3，用蒸餾水定容到250 mL，中速濾紙過濾。

2）TCA 溶液（2.5 mol/L）:稱取 408.48 g 三氯乙酸溶于蒸餾水，定容至1 L，過濾。

1.2.3 蛋白酶A酶活測定方法 將發酵液離心，取上清液即為粗酶液。在10 mL小試管中加入0.1 mL粗酶液，再加入0.1%酪蛋白溶液1 mL，混勻，40℃反應 20 min，加入 2 mL、2.5 mol/L TCA，加蒸餾水將體系體積補齊到5 mL，混勻，室溫締合20 min。空白為在酶液中先加2 mL、2.5 mol/L的TCA中止反應20 min后，再加入酪蛋白溶液。設定熒光分光光度計的發射光和激發光波長均為468 nm，狹縫均為2 nm，分別測定反應體系的共振散射光強度I4468反應和空白體系的共振散射光強度I4468空白。

2 結果與討論

2.1 菌種對蛋白酶A分泌的影響

首先考察了不同酵母菌種對啤酒釀造過程中蛋白酶A分泌的影響。分別使用實驗室保藏的6株生產用菌株在1.2.1實驗條件下進行發酵，測定發酵液中蛋白酶A的活性，結果見圖1。

如圖1所示，酵母菌株D-4和Q-05A的發酵液中檢測不到蛋白酶A活性，酵母青②（F15）和J-1的發酵液中蛋白酶A活性略低，其△I468分別為42和20，而酵母G-03（F25）和 C-03的發酵液中可以檢測到較高的蛋白酶A活性，其△I468分別為108和100。因此，不同酵母菌種蛋白酶A的分泌量不同，最終使得發酵液中蛋白酶A的活性有很大差異。酵母菌種是蛋白酶A產生的惟一來源，菌種的差異必然會帶來蛋白酶A分泌量的差異。因此，在實際生產中選擇蛋白酶A分泌量低的菌株進行發酵，會對降低發酵液及成品啤酒中蛋白酶A活性起到積極作用。

圖1 不同菌種發酵啤酒時發酵液中蛋白酶A活性Fig.1 Proteinase A activity of different strain’s fermentation broths

2.2 酵母生理狀態對蛋白酶A分泌的影響

為了考察酵母生理狀態對蛋白酶A分泌的影響，實驗選用酵母菌株G-03（F25）為研究對象，測定了其細胞濃度曲線和死亡率曲線，見圖2。在得到的曲線上選取7個時期，時期1:延遲期（2 h）、時期2:對數生長期初期（6 h）、時期3:對數生長期末期（14 h）、時期 4:穩定期初期（18 h）、時期 5:穩定期中期（28 h）、時期 6:穩定期末期（38 h）、時期 7:衰亡期（48 h）。分別測定處于這7個時期的酵母分泌的蛋白酶A活性，見圖3。

圖2 菌株G-03（F25）細胞濃度及死亡率曲線Fig.2 Cell concentration and the mortality curves of G-03（ F25）

圖3 不同生理狀態酵母分泌的蛋白酶A活性Fig.3 Activity of proteinase A secreted by yeast of different physiological state

由圖2和圖3可以看出，不同生理狀態下酵母產生的蛋白酶A活性不同。處于延遲期和對數生長期的酵母不產生蛋白酶A，而從穩定期開始可以檢測到蛋白酶A活性（△I468=426），并且隨著發酵時間的延長，蛋白酶A活性逐漸增強，至衰亡期時蛋白酶A活性高達1 179，為穩定期初期時蛋白酶A活性的2.7倍。因此，生產中接種穩定期以前的酵母進行發酵將會有效降低發酵液中蛋白酶A活性。

2.3 酵母代數對蛋白酶A分泌的影響

在實際的啤酒生產中，啤酒酵母通常會使用3～5代，為了考察不同傳代次數酵母分泌蛋白酶A的情況，在實驗室下中參照1.2.1實驗條件跟蹤測定了同一酵母菌株G-03（F25）的 0～5代發酵液中蛋白酶A的活性，結果見圖4。

圖4 同種酵母不同代數發酵液的蛋白酶A活性Fig.4 Proteinase A activity of different generation yeast’s fermentation broths

從圖4中可以看出，不同代數酵母的發酵液蛋白酶A活性不同，0～3代酵母的發酵液檢測不到蛋白酶A活性，而4代、5代酵母的發酵液可以檢測到蛋白酶A活性，其△I468分別為70和98。因此，酵母代數的增加將會導致蛋白酶A分泌量的增加。在生產中，使用較小代數的酵母，尤其是三代以內的酵母進行啤酒發酵可以降低蛋白酶A的分泌量。

2.4 原麥汁濃度對蛋白酶A分泌的影響

傳統啤酒釀造采用12°P麥汁發酵，但為了提高啤酒產量和設備利用率，目前，啤酒廠多使用高濃釀造技術。高濃釀造技術即采用高濃度麥汁糖化和發酵，啤酒成熟后，再用無菌水稀釋成不同濃度的啤酒。為了考察高濃釀造對蛋白酶A分泌的影響，在實驗室條件下測定了使用不同濃度麥汁發酵時的蛋白酶A活性，并將結果折算成12°P麥汁的數值，見圖5。

圖5 不同濃度麥汁發酵時的蛋白酶A活性Fig.5 Proteinase A activity of different concentration worts’fermentation broths

如圖5所示，使用12、14、16°P的麥汁發酵時，發酵液無蛋白酶A活性，當麥汁濃度為18°P時，在發酵液中可以檢測到蛋白酶A活性，△I468=15，當麥汁濃度為20°P時，△I468=112，當麥汁濃度為22°P時，△I468=110。因此，發酵時的麥汁濃度會對蛋白酶A的分泌產生影響，高濃度的麥汁，會迫使酵母分泌更多的蛋白酶A。在實際生產中，采用18°P以下的麥汁進行發酵，可以減少酵母蛋白酶A的分泌量。

2.5 發酵過程中蛋白酶A分泌情況

為了考察在實際的發酵過程中蛋白酶A的分泌情況，實驗中跟蹤了1 000 L大罐啤酒發酵過程中蛋白酶A的活性變化，結果見圖6。

圖6 啤酒發酵過程中蛋白酶A活性Fig.6 Proteinase A activity in beer fermentation process

從圖6可以看出，在發酵的前8天發酵液中沒有蛋白酶A活性，在發酵的第9天、第10天可以檢測到蛋白酶A活性，△I468分別為11和21。可以看出，酵母在啤酒發酵初期基本不分泌蛋白酶A，在發酵末期逐漸開始分泌蛋白酶A。在發酵初期，酵母的營養物充足，生存條件優越，蛋白酶A的產生量較低，但是，隨著營養物的消耗，酒精濃度上升，二氧化碳濃度上升等條件的變化，酵母的生存環境逐漸惡劣，導致了酵母分泌的蛋白酶A增加。因此，啤酒釀造過程中盡早結束發酵可以降低發酵液蛋白酶A活性。

3 結語

在啤酒發酵過程中有較多因素會影響酵母蛋白酶A的分泌。菌種的不同會導致發酵液中蛋白酶A的活性有很大差異，因此，在實際生產中應選擇蛋白酶A分泌量低的菌株進行發酵。處于穩定期以后的酵母分泌的蛋白酶A量顯著增加，生產中可以選擇處于此階段之前的酵母進行生產。較高的酵母代數，會使發酵液中蛋白酶A活性偏高，在生產中，應使用三代以內的酵母進行啤酒發酵。原麥汁濃度增加，會迫使酵母分泌更多的蛋白酶A，在實際生產中，可以采用18°P以下的麥汁進行發酵。在啤酒發酵過程中，酵母在發酵初期不分泌蛋白酶A，在發酵末期分泌量逐漸增加，因此，啤酒釀造過程中盡早結束發酵可以有效降低發酵液中蛋白酶A活性。

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