泡菜中乳桿菌的快速檢出和乳桿菌質粒資源的初步調查

楊四佳， 王 穎， 李宇婷， 李 晨， 張 進， 劉 銳， 潘 渠

（1.成都醫學院 基礎醫學院，四川 成都 610083；2.成都醫學院 檢驗醫學院，四川 成都 610083）

質粒是染色體外可自我復制的遺傳元件，在各類生物細胞中均有發現，對分子生物學的發展和基本生命現象的認識一直發揮著不可替代的作用。乳桿菌的質粒不僅決定了乳桿菌的某些性狀，還應用于乳桿菌克隆表達載體的構建，是一種珍貴的遺傳信息資源。

自從1976年Chassy首次在乳桿菌中發現質粒以來，已經有數十個乳桿菌質粒被發現。近年來，傳統發酵食品中的乳桿菌質粒資源被不斷的發掘。希臘傳統奶酪Kopanisti中分離到了pLAC1質粒和屬于theta復制pUCL287家族的pREN質粒。通過序列分析，在pREN質粒上發現了新的復制起始蛋白，并首次分析了pUCL287質粒家族復制起始位點的保守程度[1]。中國內蒙的馬奶酒中分離到了屬于滾環復制pMV158家族的pTXW質粒。該質粒編碼了一個移動蛋白（MOB）家族的釋放酶，并且具有較高的拷貝數，是構建載體的良好材料[2]。

中國泡菜歷史悠久，源遠流長。在四川和重慶，基本上家家戶戶都有一個泡菜壇子。已經從中國泡菜中分離了十幾種乳桿菌[3]。卻很少有人關注中國泡菜中的乳桿菌質粒。到目前為止，只報道了兩個質粒。兩個都是從四川泡菜中分離的植物乳桿菌質粒。一個是質粒pLR1，屬于滾環復制pC194家族，有36個拷貝數[4]；另一個是我們分離鑒定的質粒pLP18，屬于滾環復制pMV158家族，每個菌體有24個拷貝[5]。

為了探明中國泡菜中乳桿菌和乳桿菌質粒資源，作者開發了快速的乳桿菌檢出方法，并對52份泡菜樣品進行了檢測。檢測結果表明，中國泡菜中存在豐富的乳桿菌質粒資源，值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

采集泡菜樣品52份，主要采自四川，有4份樣品分別采自遼寧、青海和山西，見表1。乳桿菌菌株均用 MRS培養基[6]，在 37℃靜置培養 18～48 h，其它菌株使用LB培養基，在37℃培養18 h。PCR（Ex Taq）和T載體試劑盒購自大連寶生物公司（TaKaRa），質粒提取試劑盒與膠回收試劑盒購自Omega公司（Bio-Tek USA）。

表1 泡菜樣品采集地列表Table 1 Places of collection of pickle samples

1.2 革蘭染色初步鑒定

將泡菜樣品在MRS培養基上劃線接種，培養出菌落后挑取菌落繼續劃線分離2次，分離純化泡菜樣品中的細菌。MRS培養基是乳桿菌的半選擇培養基，可以富集泡菜樣品中的乳桿菌。挑取MRS培養基上的菌落進行革蘭染色并在顯微鏡油鏡下觀察（×1 000）。革蘭染色陽性，菌體為桿狀的菌株初步鑒定為乳桿菌。

1.3 PCR 檢出

利用我們設計的乳桿菌PCR快速檢出技術[7]對革蘭染色初步鑒定為乳桿菌的菌株進一步鑒定。該技術利用一對可以特異性擴增乳桿菌16S rDNA序列的引物（上游:5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATATGGAA-3′，下游:5′-GTGAT CCAGCCGCAGG TTCTCC-3′），直接挑取微量菌體為模板，特異性擴增長約850 bp的片段，可以快速鑒定乳桿菌。菌落PCR過程如下[8]:從菌落上挑取微量菌體，微波爐大火處理3 min后，加入到 PCR體系（25 μL）中進行擴增。然后取5 μL反應液進行瓊脂糖凝膠（0.7 g/dL）電泳，凝膠上出現800 bp條帶者鑒定為乳桿菌。

1.4 測序鑒定

利用通用引物（上游:5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'；下游:5'-AAGG AGGTGA TCCAG CCGC A-3'），PCR擴增細菌菌株16S rDNA全序列，擴增片段長度約為1 500 bp。使用膠回收技術純化擴增片段，再用TaKaRa公司的T載體試劑盒，通過電轉化，將目標擴增片段克隆到大腸桿菌中，然后提取重組質粒送大連寶生物公司測序。利用NCBI網站的BLASTn工具比對測序結果。最后根據測序結果將細菌菌株鑒定到種。

1.5 質粒提取

使用OMEGA質粒提取試劑盒提取乳桿菌質粒，操作步驟按照試劑盒說明書進行，只是在solution I中要加入1%的溶菌酶，同時增加37℃水浴10 min的處理步驟。用瓊脂糖凝膠電泳檢查提取結果。

2 結果與討論

2.1 革蘭染色結果

通過在MRS培養基上的劃線分離和革蘭染色鑒定，從52份泡菜樣品得到43株菌株。其中6、8、9、25、38、41、44、45、49 號等 9 個樣品未能在 MRS選擇培養基中分離到菌株；其余樣品各分離到3株菌株，各樣品3株菌株的革蘭染色結果均一致，故只保存3株菌株中的1株，菌株編號與樣品編號相同。 其中 1、2、5、14、42號等共 5株菌株革蘭染色陽性，菌體呈大卵圓形，初步鑒定為酵母菌；7、11、26～27、29、31～33、35～37、40、46、48 號等共 14 株菌株為革蘭陽性球菌； 無革蘭陰性球菌；3、10、12、13、15～24、28、30、34、39、43、47、50～52 號共 23 株菌株為革蘭陽性桿菌；4號菌株為革蘭陰性桿菌，見表2。

表2 泡菜樣品分離菌株的革蘭染色結果Table 2 Gram stain results of isolated strain from pickle samples

2.2 菌落PCR結果

對表2中列出的23株革蘭陽性桿菌用特異性引物行 PCR 擴增， 電泳顯示其中 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 號共 19 株菌株在 800 bp 左右出現清晰條帶，其余13、30、50、51號等4株菌株無條帶，見圖1。從52個泡菜樣品中鑒定到19株乳桿菌菌株，各地泡菜樣品的乳桿菌檢出率為36.5%。

圖1 革蘭陽性桿菌菌株的PCR鑒定電泳圖（PCR引物為乳桿菌特異性引物）Fig.1 PCR detection of gram-positive Bacillus（using Lactobacillus-specific primer）

2.3 測序結果

對分離的23株革蘭陽性桿菌菌株和5株革蘭陽性球菌菌株進行了16S rDNA測序。利用NCBI網站的 BLASTn 工具比對顯示，見表 3。 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 號共 19 株菌株被鑒定為乳桿菌；其它鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、有害片球菌（Pediococcus damnosus）、赫倫魏斯氏菌（Weissella hellenica）、 蠟 樣 芽 胞 桿 菌 （Bacillus cereus）、 表 皮 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus epidermidis）、 巴 氏 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus pasteuri）等。測序鑒定結果和乳桿菌PCR快速檢出結果吻合。19株乳桿菌分離株中僅鑒定為兩種乳桿菌:清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其中清酒乳桿菌1株，植物乳桿菌18株。13株植物乳桿菌的16S rDNA序列和植物乳桿菌WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1）的相似性為100%，只有5株植物乳桿菌的16S rDNA序列和植物乳桿菌WCFS1分別有1、2、6、8個堿基的差異，相似性分別是99.9%、99.6%和99.5%。15和24號植物乳桿菌分離株和植物乳桿菌WCFS1的16S rDNA序列相差同一個堿基，即15和24號植物乳桿菌兩菌株之間的相似性為100%。

表3 泡菜樣品分離菌株的16s rDNA測序結果列表Table 3 16s rDNA sequencing results of isolated strains from pickle samples

圖2 19株乳桿菌分離株的質粒提取電泳圖Fig.2 Plasmid extracts electrophoresis of 19 isolated Lactobacillus strains

2.4 質粒提取結果

提取19株乳桿菌分離株的質粒，見圖2。清酒乳桿菌沒有提到質粒，18株植物乳桿菌中7株沒有質粒，有質粒的植物乳桿菌菌株共11株。從電泳圖來看有10種質粒譜型，見表4。18株植物乳桿菌分離株在質粒譜型上表現出了遺傳差異。 提示泡菜中蘊藏著豐富的乳桿菌質粒資源。有質粒的乳桿菌分離株分別來自成都、綿陽、眉山、峨眉山、宜賓、樂山、雅安、涼山和阿壩共9個地方，分布地域較廣。從地理分布上看，有些地區有多種質粒譜型，有些地區的質粒譜型和別的地區一樣，例如:成都有P6和P9兩種質粒譜型，眉山有P2和P5兩種質粒譜型，峨眉山、宜賓和樂山的質粒譜型都是P8。這提示乳桿菌質粒的分布不是平均的，明顯存在地區差異。

表4 19株乳桿菌分離株的質粒譜型列表Table 4 Plasmid profiles of 19 isolated Lactobacillus strains

3 結語

本研究是對中國泡菜中的乳桿菌和乳桿菌質粒資源的初步調查，共分析了52份泡菜樣品。調查表明，36.5%的泡菜樣品中含有乳桿菌。理論上泡菜是植物制品，在制作中容易攜帶生長在植物表面的植物乳桿菌，所以從泡菜分離的乳桿菌絕大多數應該是植物乳桿菌。四川地區的一次對泡菜中乳桿菌資源的調查中分離了260余株乳桿菌，其中植物乳桿菌141株，占50%以上[9]，東北的泡菜中也分離到了多株植物乳桿菌[10]。這些研究表明，植物乳桿菌是泡菜中的優勢乳桿菌。我們共分離了19株乳桿菌菌株，其中植物乳桿菌就有18株，這和理論以及之前的研究結果是相吻合的。江蘇揚州地區調查了3種泡菜，發現的卻是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），沒有植物乳桿菌[11]，這可能是樣本太少的結果，也可能是地區差異所致。從地理分布上看，來自遼寧以及四川的成都、綿陽、松潘、資陽、眉山等地的泡菜樣品中皆分離到了乳桿菌。乳桿菌的分布沒有出現明顯的地域差異。在極為鄰近區域，有的泡菜樣品中有乳桿菌，有的卻沒有。例如:采集自成都金牛區不同地點的 1、15、37、49、38 和 39 號泡菜樣品只有15和39號分離到了乳桿菌；采集自成都青白江相鄰3個鎮的50、51和52號泡菜樣品只有52號樣品分離到乳桿菌。這可能是泡菜制作手法不同造成的。

本研究共檢出乳桿菌質粒譜型9種（不含無質粒的譜型），檢出含質粒乳桿菌11株，乳桿菌質粒檢出率為21.2%，乳桿菌質粒譜型檢出率為17.3%。52份泡菜樣品中28份采集自四川成都，占樣品總數的53.8%，從中分離出6株植物乳桿菌，兩種質粒譜型 （P6和P9）。成都地區的乳桿菌檢出率為21.4%，低于此次調查的乳桿菌總檢出率（36.5%）。成都地區的乳桿菌質粒譜型檢出率為7.1%，遠低于此次調查的乳桿菌質粒譜型總檢出率 （17.3%），這表明擴大樣品采集區間，而不是在狹小地域密集采樣有利于乳桿菌檢出率以及乳桿菌質粒譜型檢出率的升高。如果在廣大的地域采集更多的樣品，一定能檢出更多的乳桿菌質粒譜型。我們的初步調查可以確定的是:中國泡菜中蘊藏豐富的乳桿菌質粒資源，值得進行更大規模的調查和研究。

乳桿菌是公認安全的微生物，是目前的研究熱點之一[12]，其質粒是研究乳桿菌遺傳和生理的重要材料，也是進行基因工程的潛在載體。發掘中國泡菜中的乳桿菌質粒具有重大的研究和應用價值。

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