保護(hù)劑對(duì)膽固醇氧化酶穩(wěn)定性機(jī)理的研究

陳 亦， 辛 瑜， 楊海麟， 張 玲， 張玉然， 仝艷軍， 王 武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

膽 固 醇 氧 化 酶 （cholesterol oxidase；COD；EC 1.1.3.6）屬于黃素蛋白，能專(zhuān)一催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮，作為檢測(cè)酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域，是重要的診斷酶制劑。

診斷用酶制劑應(yīng)用中，酶穩(wěn)定性是重要因素之一，因此增強(qiáng)診斷用酶穩(wěn)定性，成為了極為迫切的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。提高酶穩(wěn)定性方法有蛋白質(zhì)工程、固定化、添加保護(hù)劑等，其中添加保護(hù)劑具有方法簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種常用的方法。酶保護(hù)劑主要有輔基、蛋白質(zhì)、多元醇、防腐劑等，其中醇類(lèi)能提高酶穩(wěn)定性。Liao Y等[1]使用甘油促使凍干的過(guò)氧化氫酶復(fù)性，隨著甘油濃度上升，過(guò)氧化氫酶復(fù)性速率加快；Costa等[2]研究多種添加劑對(duì)過(guò)氧化氫酶的影響，其中甘油和聚乙烯乙二醇能增加其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

作者所在實(shí)驗(yàn)室重組菌株E coli BL21（DE3）/pET28a表達(dá)的COD穩(wěn)定性較差，通過(guò)研究液態(tài)純酶穩(wěn)定機(jī)理，選擇甘油和核黃素兩種保護(hù)劑，結(jié)合光譜法研究保護(hù)機(jī)理，提供增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的有效方法，對(duì)該酶應(yīng)用具有重要價(jià)值，也為其他酶類(lèi)穩(wěn)定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌種來(lái)源 重組菌株 E.coli BL21（DE3）/pET28a-COD:作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠(chǎng)制造；蛋白電泳儀:美國(guó)BIO-RAD公司制造；F-7000型熒光分光光度儀:日立公司制造；MOS-450 AF-CD圓二色性光譜儀:法國(guó)Bio-Logic公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 COD純酶制備 菌種培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)見(jiàn)文獻(xiàn)[3]，酶液親和純化見(jiàn)文獻(xiàn)[4-5]，制備COD純酶液。

1.2.2 COD酶活測(cè)定方法 膽固醇氧化酶測(cè)定方法:參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 甘油對(duì)COD穩(wěn)定性影響 6 U/mL（0.15 mg/mL）、pH 7.5的純酶液分別添加體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%甘油，37℃水浴，定時(shí)取樣測(cè)定其殘余酶活，初始酶活為100%，計(jì)算酶活保留率（%）。取樣測(cè)定溶液濁度（OD340nm），同時(shí)取樣SDS-PAGE和圓二色性光譜分析（掃描范圍190～250 nm）。

1.2.4 核黃素對(duì)COD穩(wěn)定性影響 6 U/mL（0.15 mg/mL）、pH 7.5 的純酶液分別添加 10、20、40 μmol/L核黃素，37℃水浴定時(shí)取樣，測(cè)定殘余酶活及濁度，并取樣熒光分析。COD激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)280～400 nm；輔基FAD激發(fā)波長(zhǎng)460 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460～620 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 膽固醇氧化酶（COD）穩(wěn)定機(jī)理研究

COD最適反應(yīng)pH為7.5[7]，故實(shí)驗(yàn)選擇37℃、酶濃度6 U/mL、pH 7.5研究酶穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨時(shí)間延長(zhǎng)酶活降低，45 h降至2.65%；初始酶液澄清透明，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶分子運(yùn)動(dòng)速率加快，分子間碰撞速率增大，酶分子間聚集，溶液渾濁[8]。

圖1 存儲(chǔ)不同時(shí)間對(duì)COD酶活及濁度影響Fig.1 Effects of different time on cholesterol oxidase activity and turbidity

COD為單亞基蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量59 000，SDS-PAGE電泳見(jiàn)圖2。前4小時(shí)未產(chǎn)生多聚體，且目的條帶粗細(xì)大致相同，說(shuō)明酶自身未發(fā)生降解；而后逐漸出現(xiàn)多聚體條帶，可能由于COD高級(jí)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致分子間發(fā)生聚集作用。

圖2 不同存儲(chǔ)時(shí)間的COD SDS-PAGE圖Fig.2 Analysis by SDS-PAGE after different time

蛋白質(zhì)Trp、Tyr、Phe具有熒光性，F(xiàn)AD為 COD輔基，含異咯嗪環(huán)，也具熒光性[9]。圖3a中COD最大熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)先增加后減小，前8小時(shí)最大熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，主要由于COD內(nèi)部Trp、Tyr等疏水性基團(tuán)逐漸暴露，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度上升；后期最大熒光強(qiáng)度逐漸降低，可能由于聚集導(dǎo)致一些原本處于單分子表面的Trp、Tyr包裹于聚集體內(nèi)部，熒光強(qiáng)度降低。

圖3b顯示輔基FAD熒光圖譜，其最大熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射峰變化均不明顯。24 h內(nèi)FAD熒光強(qiáng)度變化不大，通常COD與FAD結(jié)合摩爾比為1∶1，圖3中與COD同等摩爾濃度的核黃素（B2）溶液熒光強(qiáng)度明顯高于FAD，而且大腸桿菌不能提供充足FAD，且其自身不能進(jìn)入細(xì)胞，只能通過(guò)將核黃素運(yùn)輸至胞內(nèi)，并經(jīng)濃縮和磷酸化作用轉(zhuǎn)化為輔酶FAD[10]，因此推斷COD大量表達(dá)過(guò)程中，由于輔酶FAD合成速度有限，未能完全結(jié)合FAD輔基。

圖3 不同存儲(chǔ)時(shí)間COD和FAD的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of cholesterol oxidase（a） and FAD（b）under different time

在圖4中，COD在24 h二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰基本消失，說(shuō)明其天然構(gòu)象破壞，酶變性失活。

通過(guò)酶活力、濁度、SDS-PAGE、熒光光譜及圓二色性光譜分析，37℃存儲(chǔ)過(guò)程中，COD內(nèi)部疏水基團(tuán)逐漸暴露，二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，分子間聚集導(dǎo)致溶液濁度上升，酶分子變性，導(dǎo)致酶活力下降，同時(shí)熒光光譜顯示COD在表達(dá)過(guò)程中未充分結(jié)合FAD。因此，導(dǎo)致溶液COD不穩(wěn)定因素主要有酶蛋白聚集導(dǎo)致構(gòu)象變化以及缺乏輔基FAD。

圖4 存儲(chǔ)不同時(shí)間COD圓二色性光譜Fig.4 CD spectra of cholesterol oxidase under different time

2.2 甘油對(duì)COD穩(wěn)定性影響

圖5表示不同甘油濃度對(duì)COD酶活及濁度影響，濃度愈大保護(hù)作用愈強(qiáng)，45 h時(shí)15%甘油組酶活保留率60.25%，而對(duì)照組酶活保留率僅為2.2%。圖5b甘油組酶液濁度低于對(duì)照組，30 h對(duì)照組OD340nm為0.461，甘油組OD340nm最高值僅為0.077。

圖5 不同甘油體積分?jǐn)?shù)對(duì)COD酶活和濁度影響Fig.5 Effects on cholesterol oxidase activity （a） and turbidity（b）under different glycerol concentration

圖6為不同體積分?jǐn)?shù)甘油對(duì)COD的SDSPAGE圖，a為對(duì)照組，8 h開(kāi)始出現(xiàn)聚集體；5%甘油組30 h出現(xiàn)微量聚集體條帶，而10%和15%甘油組45 h未出現(xiàn)聚集。

圖6 不同甘油體積分?jǐn)?shù)下COD的SDS-PAGE圖Fig.6 Analysis by SDS-PAGE under different glycerol concentration

圖7顯示COD在添加不同體積分?jǐn)?shù)甘油的CD光譜，對(duì)照組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸喪失，24 h二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰基本消失，酶分子基本變性；甘油對(duì)COD的保護(hù)作用明顯，24 h COD二級(jí)結(jié)構(gòu)保持較好，維持酶分子高級(jí)構(gòu)象，使酶分子保持穩(wěn)定。

圖7 不同甘油濃度下COD的圓二色性光譜Fig.7 CD spectra of cholesterol oxidase under different glycerol concentration

甘油能提高溶液粘度和增加分子表面水化層，粘度上升減少肽鏈間的碰撞，抑制酶分子間聚集[11]，CD光譜顯示甘油維持酶分子二級(jí)構(gòu)象免遭破壞，維持酶分子天然構(gòu)象，提高酶穩(wěn)定性，表現(xiàn)酶活力相對(duì)穩(wěn)定。

2.3 核黃素對(duì)COD穩(wěn)定性影響

除諾卡氏菌Nocardia產(chǎn)的COD外[12]，其他微生物源的COD均以FAD為輔基，本實(shí)驗(yàn)中COD與FAD屬于非共價(jià)結(jié)合，而且大量表達(dá)COD時(shí)未完全結(jié)合FAD，因此添加FAD類(lèi)似物的核黃素（B2）研究對(duì)COD穩(wěn)定性影響。

不同濃度B2對(duì)COD酶活及濁度的影響結(jié)果見(jiàn)圖8。加入B2的酶活保留率與對(duì)照組沒(méi)有明顯差別，29 h對(duì)照組OD340nm0.348，B2組OD340nm最大為0.431，溶液渾濁產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，B2對(duì)COD未起保護(hù)作用，可能由于B2未與COD結(jié)合或者B2雖于COD結(jié)合但并未抑制其聚集。

圖8 不同B2濃度對(duì)COD酶活和濁度影響Fig.8 Effects on cholesterol oxidase activity （a） and turbidity （b） under different riboflavin concentration

圖9是不同濃度B2存在下，COD內(nèi)源熒光及B2熒光圖譜，B2具有異咯嗪環(huán)，因此也具熒光性。圖9a中隨B2濃度增加，熒光強(qiáng)度增幅愈小，可能由于B2和COD結(jié)合，使一部分疏水基團(tuán)內(nèi)埋于內(nèi)部疏水環(huán)境中，同時(shí)COD最大發(fā)射峰未明顯移動(dòng)，見(jiàn)圖9b。圖9c表示B2熒光光譜，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其熒光強(qiáng)度逐漸降低，可能原因有兩個(gè)，一是B2異咯嗪環(huán)與COD結(jié)合導(dǎo)致B2熒光猝滅，另一可能就是B2降解致使熒光強(qiáng)度降低。圖3b中B2在24 h后熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明24 h內(nèi)B2未發(fā)生降解，表示該現(xiàn)象是由于B2與COD結(jié)合導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。

圖9 不同B2濃度下COD和相應(yīng)B2熒光圖譜Fig.9 Fluorescence spectra of cholesterol oxidase under different riboflavin concentration

熒光光譜表明B2與COD結(jié)合，抑制一部分疏水基團(tuán)暴露，但由于該抑制作用較弱，未能防止COD間聚集，溶液濁度上升，COD構(gòu)象變化，對(duì)COD穩(wěn)定作用不佳。由于甘油能防止酶分子間聚集，通過(guò)向酶液中添加10%甘油，再以COD與B2摩爾比 1∶1、1∶5、1∶10 添加不同濃度的核黃素，分析其對(duì)COD穩(wěn)定性影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。隨摩爾比升高，酶活保留率卻逐漸降低，65 h對(duì)照組酶活保留率39.3%，摩爾比1∶1組酶活保留率31.4%，而摩爾比1∶10組的酶活保留率卻只有9.8%，核黃素由異咯嗪基和核糖醇基構(gòu)成的一種B族維生素[13]，核黃素的異咯嗪基雖與FAD結(jié)合域結(jié)合，但由于COD的FAD結(jié)合域口袋較淺，因此核黃素對(duì)COD穩(wěn)定性作用不顯著，而且摩爾比越大酶活保留率越低，可能由于過(guò)多的核黃素，其疏水基團(tuán)與COD分子疏水基團(tuán)結(jié)合，對(duì)COD構(gòu)象具有不利影響，因此產(chǎn)生不利的穩(wěn)定作用。

圖10 不同摩爾比B2及甘油對(duì)COD活性影響Fig.10 Synthetic effects of different molar ratio of riboflavin and glycerol on cholesterol oxidase activity

3 結(jié)語(yǔ)

研究分析了COD不穩(wěn)定機(jī)理，由于COD內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露導(dǎo)致聚集以及缺乏輔基FAD，導(dǎo)致二級(jí)構(gòu)象破壞，酶變性失活，造成酶分子不穩(wěn)定。根據(jù)失活機(jī)理，選用甘油、核黃素兩種保護(hù)劑，研究其對(duì)COD穩(wěn)定性影響，甘油提高溶液粘度和分子表面水化層，防止分子間聚集，二級(jí)構(gòu)象保持良好，酶活力相對(duì)穩(wěn)定，酶穩(wěn)定性提高；核黃素作為COD的輔基類(lèi)似物，雖能與COD結(jié)合，抑制部分疏水基團(tuán)暴露，但由于COD的FAD結(jié)合域口袋較淺，且過(guò)多核黃素的疏水基團(tuán)與COD分子疏水基團(tuán)結(jié)合，對(duì)COD穩(wěn)定性產(chǎn)生不利的影響；實(shí)驗(yàn)結(jié)論不僅提供了可穩(wěn)定COD酶液的方法，而且研究了其保護(hù)機(jī)理。

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