動物食品中去甲基睪丸酮的納米增強酶聯免疫分析方法

劉春麗 ， 宋珊珊 ， 劉麗強 ， 張 鵬 ， 彭池方 *

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

去甲基睪酮（nortestosterone ，NT），簡稱諾龍，是一種合成甾體激素，具有雄激素樣作用的同化激素[1]。臨床主要用于治療貧血、老年性骨質疏松、惡病質及男性避孕藥的研究等。由于NT具有很強的促蛋白合成作用，也被非法用于運動員以提高運動成績和動物飼料添加劑[1-2]。去甲睪酮作為動物飼料添加劑會在食用動物的肝、腎等組織中殘留，過量攝入高殘留的NT的動物組織后可產生激素樣作用，如破壞人機體的激素平衡、干擾人的內分泌功能、影響生育能力、發育毒性（兒童早熟和女性男性化），可導致糖尿病，高劑量積累甚至可誘導心血管疾病[3-4]。

已有許多用于NT檢測的方法報道，包括氣相色譜-質譜、液相色譜-質譜方法[5-6]。色譜-質譜聯用是一種非常靈敏和準確的激素藥物檢測方法，但是這些方法需要高技能的操作人員，離不開昂貴的大型設備和大型的實驗室，而且其檢測是一個冗長繁瑣的過程。因此，這些弱點限制了這類方法的應用。免疫分析能夠克服以上色譜-質譜方法的不足，如作者所在研究室開發的檢測NT的酶聯免疫分析（ELISA）[7]、膠體金免疫層析檢測[8-9]方法，具有測試操作簡單、儀器廉價、速度快、樣品檢測通量高等優點，因此可應用于大量生物樣品的篩選檢測。最近有報道NT的單克隆抗體篩選成功[10]，并建立NT的免疫檢測方法，將有利于該技術和產品的穩定供應。進一步提高以上方法的靈敏度，可在實際樣品前處理采用高稀釋倍數，從而降低樣品基質的干擾，提高檢測結果的重復性和準確性。作者利用金納米粒子的高比表面積，采用酶標抗體修飾的金納米粒子作為ELISA中的探針，建立了一種新型的基于納米增強的酶聯免疫分析方法。與傳統ELISA方法相比，該方法的檢測靈敏度提高了10倍。因此，該方法在免疫分析中具有誘人的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 氯金酸，檸檬酸鈉、卵清蛋白（OVA）:均購自Sigma公司；去甲睪酮兔源抗體:作者所在實驗室自制；辣根過氧化物酶標羊抗兔（HRP-IgG）:購自吉泰生物公司；三丁胺、氯甲酸異丁脂、羧甲基羥胺半鹽酸:購自TCI化學公司。其他有機溶劑和無機鹽均為分析純。

1.1.2 儀器 酶標儀:熱電儀器；Biomate6微量分光光度計:熱電科學；Nano ZS動態激光散射儀:DLS，馬爾文；H-800透射電鏡:TEM，日立公司。

1.2 人工抗原NT-OVA的制備

稱取275 mg（約1 mmol）NT溶于10 mL無水吡啶，然后加入219 mg（約2 mmol）羧甲基羥胺半鹽酸，50℃攪拌反應30 min。減壓蒸餾去吡啶。殘余物用50～100 mL乙酸乙酯溶解，加適量水洗3～4次。取上層油樣，加入少量無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結晶。

采用混合酸酐法與卵清蛋白（OVA）偶聯。所得產物用雙蒸水 （2 L）透析2 d，每日更換緩沖液4次，最后兩次用PBS透析，4℃下保存備用。

1.3 金納米粒子的制備

取100 mL質量濃度為0.1 g/dL的氯金酸溶液，放入經王水充分洗滌的燒瓶（250 mL）中，攪拌下用油浴加熱至沸騰，加入2 mL檸檬酸鈉溶液 （質量分數1%），溶液變成酒紅色后繼續加熱保持沸騰20 min。測試所得金納米溶液光吸收曲線，計算其濃度為2 nmol/L[11]，同時透射電鏡（TEM）觀察其粒徑和分散性。

1.4 酶標抗體-金納米粒子偶聯物的制備

配置質量濃度為0.2 mg/mL的酶標抗體（HRPIgG）水溶液，取100 μL溶液，加入于1 mL膠體金溶液中，加入不同量的 200 mmol/L的K2CO3溶液（0，1，2,3 μL），室溫下避光振蕩 1 h（500 r/min），4 ℃下靜止24 h。觀察溶液顏色變化，并測試其400～800 nm范圍光吸收曲線，取顏色無變化、光吸收曲線沒有擴展的溶液。最終選擇酶標抗體-膠體金（HRP-IgG-GNP）的制備條件為:0.1 mg/mL酶標抗體，2 μL 的 K2CO3溶液。

1.5 納米金-酶標二抗的光譜和粒徑分析

用微量分光光度計測試400～800 nm波長范圍GNP和HRP-IgG-GNP的吸收光譜。采用DLS測試3種樣品的平均粒徑，每種樣品測試3次，取平均粒徑測試結果的平均值為各樣品的水合粒徑。

1.6 納米增強酶聯免疫法建立

與傳統酶聯免疫法的操作步驟相同[7]。首先采用 NT-OV（100 μL/孔）包被微孔板，PBST 洗液洗滌后，以 0.5%的 OVA 封閉（200 μL/孔），洗液后得到敏化的微孔板，將其4℃下干燥保存備用。向微孔中分別加入不同濃度的標準溶液（50 μL/孔）。以抗體稀釋液稀釋抗體（50 μL/孔），振蕩 1 min 后，37 ℃孵育30 min。洗液充分洗滌后，加入抗體稀釋液稀釋一定倍數的 HRP-IgG-GNP 復合物（100 μL/孔），37℃下孵育15 min。洗滌后加入TMB顯色液（100 μL/孔），37 ℃反應 15 min， 加入 2 mol/L 硫酸（100 μL/孔）終止反應。酶標儀中檢測450 nm處的光吸收值。

1.7 樣品前處理

取經過確證未受NT污染的牛肉樣品，每份2 g，剪碎，采用高濃度NT標準溶液添加，添加標準溶液后，靜置30 min，得到NT質量濃度分別為 1、5、20 μg/mL的模擬樣品。向上述樣品中加入4 mL緩沖液 PBS（pH 8.0，0.01 mol/L）和 1 mL 甲醇，高速下勻漿2 min，5 000 r/min離心10 min。吸取上清液，以PBS（pH 8.0，0.01 mol/L）緩沖液稀釋8倍。在ELISA分析中，每個微孔加入50 μL的該樣品溶液，所得結果對照校正曲線計算得到測試濃度。

2 結果與討論

2.1 人工抗原NT-OVA分析

對NT、OVA、NT-OVA進行光譜掃描，結果見圖1。NT-BSA的吸收光譜分別具有NT和OVA的吸收特征，并且由于在蛋白質結構上偶聯了一定量的NT分子，導致了蛋白質特征峰的偏移，可以證明成功制備了人工抗原。

圖1 NT、OVA和NT-OVA的紫外吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of NT、OVA and NT-OVA

2.2 HRP-SA-GNP生物偶聯物的表征

GNP和納米-酶復合物（HRP-IgG-GNP）的吸收光譜見圖2。由圖2可知:GNP的最大吸收峰為518 nm，當前述條件下GNP表面吸附一定量的HRP-IgG-GNP后，最大吸收峰紅移11 nm，達到529 nm。這與GNP隨著粒徑增大，其共振吸收峰紅移的規律是一致的。

圖2 GNP及HRP-IgG-GNP的吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of GNP and HRP-IgG-GNP

采用DLS分析GNP和HRP-IgG-GNP的粒徑分布，比較GNP和HRP-IgG-GNP的水合分子半徑，可以定性地觀察GNP表面分子覆蓋的程度，結果見圖3。計算GNP和HRP-IgG-GNP的粒徑分布，平均水合粒徑分別為 18 nm和33 nm。GNP結合了HRP-IgG-GNP后，其粒徑增加了15 nm，與HRP-IgG的水合分子半徑相近。這說明HRP-IgGGNP與GNP的結合是比較緊密的，有利于其作為酶標記物的穩定使用。

圖3 GNP和HRP-IgG-GNP的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of GNP and HRP-IgGGNP

采用透射電鏡（TEM）分析納米金及其結合酶標二抗復合物，結果見圖4，可見檸檬酸還原法制備的GNP粒徑為16 nm左右，粒徑均一，分散性好，GNP表面結合HRP-IgG后，仍然保持均一的粒徑和單分散性。

2.3 納米增強ELISA分析NT

采用傳統ELISA方法的溶液體系，經方正法選擇抗原、抗體和酶標記物的質量濃度，質量濃度分別 為 4.0 μg/mL 的 NT-OVA、1.2 μg/mL 的 NT 抗體，金納米-酶標記物（HRP-IgG-GNP）的稀釋倍數為100倍。對不同質量濃度的NT標準溶液檢測結果見圖5。其檢測靈敏度為0.01 ng/mL（定義抑制率為90%處，檢測線性范圍為0.03～100 ng/mL（R2=99.3%），而傳統ELISA方法的檢測靈敏度為0.1ng/mL，檢測線性范圍為 0.3 ～10 ng/mL（R2=99.7%），兩者相比，基于納米增強的ELISA方法的靈敏度提高了10倍。以上結果說明，納米金負載多個酶標二抗，顯示出一定的放大效應，因此，作為新型的酶標二抗試劑應用于ELISA方法中，具有廣泛的應用潛力。

圖4 TEM 圖：GNP （a）和 HRP-IgG-GNP （b）Fig.4 Transmission electron microscopy images of GNP（a） and HRP-IgG-GNP （b）

圖5 兩種ELISA方法檢測NT的校正曲線Fig.5 Calibration curve for the two ELISAs against NT

2.4 分析應用

在樣品處理中采用了高稀釋倍數的方法，對降低樣品基質的干擾具有明顯作用[11-12]。對殘留范圍1.0～20 μg/kg的牛肉樣品，檢測回收率可達到87.8～96.2%，相對偏差小于9%。相比傳統ELILSA方法，檢測結果的更準確、重復性更高[7，11]。

表1 牛肉樣品添加回收率的測定 （n=5）Table1 RecoveryofNT in beefdetected bythe nanoparticle-enhanced ELISA

3 結語

通過簡單的方法在納米金表面負載ELISA檢測中常用的酶標二抗分子，可得到更高活性的酶標二抗-納米金復合物。該復合物具有單分散性和高催化活性等優點，將其應用于激素NT的ELISA檢測中，可將傳統ELISA方法的靈敏度提高10倍，同時改善檢測的準確性和重復性。該方法有望在ELISA和其它免疫分析方法中獲得廣泛應用。

[1]Delbeke F T，Desmet N ，Debackere M.The abuse of doping agents in competing body builders in Flanders （1988－1993）[J].Int J Sports Med，1995，16（1）:66-70.

[2]Sauer M J，Samuels T P，Howells L G，et al.Residues and metabolism of 19-nortestosterone laurate in steers[J].Analyst，1998，123（12）:2653-2660.

[3]Brannnvall K，Bogdanovic N，Korhonen L，et al.19-Nortestosterone influences neural stem cell proliferation and neurogenesis in the rat brain[J].Eur J Neurosci，2005，21（4）:871-878.

[4]Bahrke M S，Yesalis C E.Abuse of anabolic androgenic steroids and related substances in sport and exercise[J].Curr Opin Pharmacol，2004，4（6）:614-620.

[5]Yamada M，Aramaki S，Kurosawa M，et al.Simultaneous doping analysis of main urinary metabolites of anabolic steroids in horse by ion-trap gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Sci，2008，24（9）:1199-1204.

[6]Grace P B，Drake E C，Teale P，et al.Quantification of 19-nortestosterone sulphate and boldenone sulphate in urine from male horses using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（19）:2999-3007.

[7]Xu C L，Peng C F，Hao K，et al.Determination of 19-nortestosterone residue in aquaculture tissues by enzyme-linked immunosorbent assay and comparison with liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].Intern J Environ Anal Chem，2006，86（11）:819-832.

[8]Liu L Q，Peng C F，Jin Z，et al.Development and evaluation of a rapid lateral flow immunochromatographic strip assay for screening 19-nortestosterone[J].Biomed.Chromatogr，2007，21（8）:861-866.

[9]Tian Z，Liu L Q，Peng C F，et al.A new development of measurement of 19-nortestosterone by combining immunochromatographic stip assay and image software[J].Food Agric Immunol，2009，20（1）:1-10.

[10]Jiang J Q，Wang Z L，Zhang H T，et al.Monoclonal antibody-based ELISA and colloidal gold immunoassay for detecting 19-nortestosterone residue in animal tissues[J].Agric Food Chem，2011，59（18）:9763-9769.

[11]Peng C F，Chen Y W，Wei C N，et al.Development of a sensitive heterologous ELISA method for analysis of acetylgestagen residues in animal fat[J].Food Chemistry，2008，109（3）:1647-653.

[12]彭池方，沈崇鈺，安可婧，等.高效液相色譜-串聯質譜聯用測定脂肪中乙酰孕激素殘留[J].分析化學，2008，36（8）:1117-1120.PENG Chi-fang， SHEN Cong-yu，AN Ke-jing.Analysis of acetylgestagens residues in animal fat by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，2008，36（8）:1117-1120.（in Chinese）

[13]王黎麗，陳芳芳，吳超，等.基于單克隆抗體的三聚氰胺ELISA檢測方法的建立[J].食品生物技術學報，2011，31（6）:962-967.WANG Li-li，CHEN Fang-fang，WU Chao，et al.Establishiment of ELISA methods for detecting melamine based on monoclonal antibodies[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，31（6）:962-967.（in Chinese）