啤酒酵母自溶液中的物質變化及酵母自溶評價指標探索

許維娜 ， 王金晶 ， 陳 希 ， 李 崎 *

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，活性高的強壯酵母在適當條件下能夠釀造出優質啤酒，酒體穩定性好，無雜異味，爽口且貨架期長。如果使用衰老、活性低的酵母生產啤酒，酵母在發酵過程中容易自溶，并在自溶過程中釋放出對啤酒質量有較大負面影響的物質，產生酵母味，加重苦味、澀味，使酒體泡持性及穩定性變差，嚴重影響啤酒質量[1-2]。Babayan和Bezrukov將自溶定義為細胞死亡，胞內生物聚合體在水解酶作用下形成低相對分子質量產物的一種水解反應，當細胞自身的胞內酶開始起作用時，自溶就開始了[3]。在正常條件下，酵母中的蛋白酶不會跟細胞內自身物質發生反應，不會發生細胞自溶；而當工藝條件和生存條件惡化時，酵母衰老受到各種物理化學作用的影響，蛋白酶開始降解胞內自身物質，導致酵母細胞壁破裂，酵母自溶隨之開始[4]。自溶液中含有從細胞中釋放出的多糖、氨基酸、蛋白質、核苷酸、少量鹽類等物質[5]。ASBC報道，在酵母自溶過程中，游離脂肪酸辛酸和癸酸的含量與其自溶有關，但測定方法比較復雜[6]；國外研究者通過實驗指出，可通過測定培養液中的腺苷酸激酶（AK）含量判定酵母的自溶，因為AK是一種胞內酶，健康的細胞并不分泌或排泄該酶，但是該方法中所使用的儀器較難獲得[7]；Matteo Cavagna等人通過ATR-FTIR顯微技術和PCA技術的結合，能夠根據中紅外顯微紅外光譜觀察到起泡酒生產過程中酵母自溶的變化，但是該方法可操作性差[8]；王敏等人研究發現，酵母自溶過程中△非α-氨基氮/△α-氨基氮值在2.24～7.91之間，比值越小自溶程度越高，可以通過該比值判斷酵母自溶的程度[9]。作者綜合了酵母自溶過程中釋放的物質種類及自溶液狀態變化情況，選取了α-氨基氮、甲醛氮、各種相對分子質量蛋白質、游離長鏈脂肪酸、酵母死亡率、以及溶液在260 nm與280 nm下分光光度值等指標對自溶液進行分析測定，探究操作性更強的酵母自溶評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母青2（S.pastorianus）、啤酒酵母G-03（S.pastorianus）、啤酒酵母 C-03（S.pastorianus）、啤酒酵母 5-2（S.pastorianus）:均為工業菌株，由作者所在實驗室保藏；YEPD培養基:參照文獻[10]配制；酵母提取物和胰蛋白胨:購于英國OXOID公司；十七酸為進口色譜純標樣:購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

掃描電子顯微鏡QUANTA200F:美國FEI公司；紫外分光光度計UV-2000:美國Unico公司；凱式定氮儀Kjeltec 8200:瑞典Foss-Tecator公司；氣相色譜儀GC-2010:日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母樣品制備 參考王敏等[9]的方法培養和收集酵母，2 g酵母泥加到200 mL、pH 4.0的檸檬酸鹽緩沖液（模擬自溶液）中，于28℃放置，定時取樣測定。

1.2.2 酵母細胞掃描電鏡鏡檢 取自溶較快的菌株青2進行掃描電鏡鏡檢。分別取在YEPD培養基中培養20 h和在模擬自溶液中7 d的酵母，1 500 r/min離心10 min，收集菌體，進行掃描電鏡制樣、鏡檢。

1.2.3 酵母細胞死亡率的測定 定時對自溶液取樣，適當稀釋后與等量0.1%美藍染色液混勻，染色5 min后加到血球計數板上鏡檢，藍色為死細胞，無色為活細胞，記錄細胞總數和死細胞數。

酵母死亡率=死細胞數/細胞總數×100%

1.2.4 α-氨基氮的測定 參照文獻[11]進行，計算公式為:

游離 α-氨基氮（mg/L）=2×10×（A樣品/A甘氨酸）

1.2.5 甲醛氮的測定 參照文獻[11]進行，計算公式為:

其中，c為氫氧化鈉標準溶液質量濃度，V為氫氧化鈉溶液用量（mL），14為每毫克當量氮的毫克數。

1.2.6 隆丁區分法測定蛋白質含量 參照文獻[12]進行，各分子氮含量計算方法:

1.2.7 液液萃取—氣相色譜法測定游離長鏈脂肪酸含量 取75 mL濾液，加入十七酸標樣0.5 mL和氯化鈉10 g，用鹽酸調pH到3.5左右。加入20 mL 萃取劑（二氯甲烷∶甲醇=3∶1）充分振蕩萃取，分層后收集有機相，上層加入10 mL萃取劑再連續萃取兩次，合并后于5 000 r/min離心10 min，收集有機相于三角瓶中，加入無水硫酸鈉，封口膜封口，放入-18℃冷凍過夜。

將有機相旋轉蒸發至干，用萃取劑潤壁至3～5 mL左右，放入氨基小柱，用3 mL正己烷沖氨基小柱，然后用移液管向柱內加萃取液，加樣量在3 mL左右，自然排干，用2 mL二氯甲烷∶異丙醇=1∶1混合溶液沖洗兩次，洗掉中性甘油酯，排干。移取2.5 mL 2%醋酸-甲基叔丁基醚，廢棄洗脫液。小柱下端接樣品瓶，再次加入2.5mL 2%醋酸-甲基叔丁基醚，收集洗脫液，充分混勻。濾液放于具塞比色管中。60℃水浴揮發至1 mL左右，冷卻，加入3 mL甲醇，3滴濃硫酸，混勻后60℃水浴中酯化30 min，冷卻后加入1 mL飽和氯化鈉和3 mL正己烷進行萃取，分層后取有機相于進樣瓶中進行氣相檢測[13-15]。

1.2.8 A260和A280的測定與比值計算 取一定量的緩沖液過濾，分別測濾液在260 nm和280 nm處的分光光度值，計算A260/A280比值。DNA純品的A260/A28為1.8，若比值高則說明含有RNA，比值低說明有殘余蛋白質的存在[17]。

2 結果與分析

2.1 酵母掃描電鏡結果

典型啤酒酵母青2在正常培養和自溶狀態下的掃描電鏡鏡檢結果分別見圖1和圖2。正常培養下的啤酒酵母呈橢圓球形，表面飽滿圓潤，有明顯的出芽現象和芽痕，而放置在模擬自溶液中經過7 d之后的酵母細胞在8 000×的放大倍數下表面無明顯破損，但胞內物質流失嚴重，細胞干癟失形。這說明自溶過程中細胞壁的破壞是局部的、小規模的，而非大面積破裂。

圖1 青2在YEPD中培養20 h的掃描電鏡Fig.1 SEM of the strain QING 2 cultured in YEPD for 20 h

圖2 青2在模擬自溶液中7 d的掃描電鏡Fig.2 SEM of the strain QING 2 placed in citrate buffer for 7 d

2.2 酵母細胞死亡率的測定

酵母細胞在模擬自溶液中死亡率見表1。菌株5-2的死亡速率明顯比其他三株菌慢。

2.3 Δ非α-氨基氮/Δα-氨基氮與自溶時間的關系曲線的構建

2.3.1 α-氨基氮的測定 對4株菌的模擬自溶液進行α-氨基氮的測定，結果見圖3。4株菌自溶液中的α-氨基氮質量濃度在0～36 h內增加緩慢，36 h之后增加速度明顯變快。其中菌株5-2的α-氨基氮質量濃度明顯低于其他三株菌。

表1 不同酵母菌株在模擬自溶液中的死亡速度Table 1 Mortality rate of different strains in citrate buffer

圖3 不同菌株模擬自溶液中α-氨基氮質量濃度變化Fig.3 Change of α-amino nitrogen of different strains in citrate buffer

2.3.2 甲醛氮的測定 對4株菌的模擬自溶液進行甲醛氮的測定，結果見圖4。0 h即剛放入時，模擬自溶液中的5-2、C-03和青2三株菌甲醛氮質量濃度相差不大，而G-03的甲醛氮質量濃度比其他三個菌株都高；四株菌甲醛氮質量濃度均緩慢增加，其中以5-2增長速度最慢，總量最少。

圖4 不同菌株模擬自溶液中甲醛氮隨時間的變化Fig.4 Change of formaldehyde nitrogen of different strains in citrate buffer

2.3.3 酵母自溶過程中△非α-氨基氮/△α-氨基氮的變化規律 對測得的α-氨基氮、甲醛氮的含量進行分析處理，得到△非α-氨基氮/△α-氨基氮變化見圖5。結果表明，△非α-氨基氮/△α-氨基氮顯示出無規律變化的趨勢，無法獲得文獻[9]中所述的酵母自溶的判定指標，造成該結果的主要原因是:該實驗方法靈敏度較低，且步驟繁瑣，可重復性不強。

圖5 不同菌株模擬自溶液中Δ非α-氨基氮/Δα-氨基氮隨時間的變化Fig.5 Change of Δ non-α -amino nitrogen/Δα -amino nitrogen of different strains in citrate buffer

2.4 酵母自溶對不同相對分子質量蛋白質質量濃度的影響

用隆丁區分法對4株酵母菌株的模擬自溶液進行跟蹤測定，對模擬自溶液中大、中、小分子蛋白質質量濃度的變化以及各相對分子質量蛋白質在總蛋白中所占的比例進行了分析，結果見表2。其中菌株5-2的自溶液中蛋白質質量濃度過低，無法用該法檢出。正常情況下，胞內物質進入外界環境需要經過細胞膜和細胞壁的過濾（其中主要是細胞膜的作用），所以胞內的大分子物質無法釋放到胞外。從表2可以看出，隨著自溶時間的延長，3株菌株模擬自溶液中大、中、小分子蛋白質質量濃度都在逐漸增多，且大、中分子蛋白質在總蛋白質的比例中呈現逐漸上升趨勢，而小分子蛋白質占總蛋白質質量濃度的比例則出現逐漸下降趨勢。如青2中高、中分子蛋白質所占比例分別從2.81%、8.79%逐漸增加至7.22%、18.89%，而小分子蛋白質從88.40%逐漸減少至73.89%。可見，在酵母細胞自溶過程中，隨著細胞膜與細胞壁上孔洞的增大，越來越多的大分子胞內物質釋放到環境中，使得外界環境中的大、中、小相對分子質量蛋白質的比例發生改變。隆丁區分可以在一定程度上檢測酵母自溶過程中蛋白質類物質的變化，但操作繁瑣，檢測限高，不適用于判斷酵母的自溶情況。

表2 不同菌株模擬自溶液中各種蛋白質質量濃度及比例變化Table 2 Change of content and proportion of proteins in citrate buffer

2.5 液液萃取-氣相色譜法測定游離長鏈脂肪酸質量分數

啤酒中含量極低、極不穩定的游離脂肪酸是影響啤酒風味重要因素之一。作者采用溶劑萃取和氣相色譜聯用技術對青2和C-03進行14個碳原子以上的長鏈游離脂肪酸質量分數的檢測，檢測結果見表3。兩株酵母緩沖液中各游離脂肪酸以及所有游離脂肪酸的總和在0～5 d的時間內變化均不明顯，且這些微小變化并不呈現確定的規律，可見，長鏈脂肪酸質量分數無法作為判定酵母自溶的指標。

2.6 紫外吸收法測定核酸物質的含量及純度

對模擬自溶液進行過濾之后測A260和A280的值，并計算其比值，結果見表4。A260/A280的比值與DNA純度有關，純DNA其比值為1.8，高于此值說明有RNA存在，低于此值有蛋白質存在，該部分的計算結果均高于1.8，同時之前的實驗證明自溶液中蛋白質的存在，因此說明了自溶液中RNA也存在。自溶開始時，酵母釋放出的蛋白類物質比例較大，A260/A280的值較小；隨著自溶程度的增大，自溶液中的核酸類物質所占的比例越來越大，A260/A280的值逐漸增大，向2.0靠近。

酵母的自溶程度與酵母的死亡率有一定關系，但酵母死亡并不等同于自溶。該實驗中，對A260/A280與酵母死亡率進行擬合與分析，發現（A260/A280）/死亡率隨自溶程度的不同而呈現明顯且一致的變化趨勢，見圖 6。（A260/A280）/死亡率起始值較大（理論上 0 h時細胞死亡率為0，該值為+∞），之后逐漸減小，且酵母菌株自溶程度越高，該比值越小。當細胞死亡率趨近于 100%時，A260/A280逐漸趨近于 2.0，（A260/A280）/死亡率的值也趨近于2。雖然具體數據因菌種不同存在個體差異，但趨勢是完全相同的。該方法還可用于比較不同菌株的自溶性能，從結果可以看出，實驗所用4株菌自溶性能最好的是5-2，其次為C-03和G-03，青2最差，這與實際情況相符合。因此，該方法能夠較準確反映酵母自溶情況，因而能夠作為酵母自溶的判定指標。

圖6 不同菌株模擬自溶液中（A260/A280）/死亡率隨時間的變化Fig.6 Change of （A260/A280）/yeast mortality of different strains in citratce buffer

表3 青2、C-03模擬自溶液中游離脂肪酸隨時間的變化Table 3 Change of free long-chain fatty acid of QING 2 and C-03 in citrate buffer

表4 不同菌株模擬自溶液中A260/A260值隨時間的變化Table 4 Change of A260/A260of different strains in citrate buffer

3 結語

在啤酒釀造中，影響啤酒質量的因素有很多，如:生產原料、水質、啤酒酵母、酒花、環境溫度等，其中酵母菌種是影響啤酒質量最主要的因素，如果有5%的酵母發生自溶，將對啤酒質量造成難以挽回的影響[2，18]。為了提高啤酒質量，國內外學者對酵母自溶進行了諸多研究，國內學者的研究多從實際生產出發，方法簡單快捷，但通常不是十分有效[5，19]；國外學者采用的方法因設備或技術限制，在國內推廣的空間不大[6-8]。因此需要探索簡單、快捷、靈敏的方法用于檢測啤酒酵母的自溶情況。

作者選取了多個指標進行自溶評價的探索。因為酵母在發酵液中的自溶是一個緩慢而漫長的過程，并且發酵液中的很多物質對測定結果有干擾[20]，所以本研究中的酵母自溶在人為創造的、營養匱乏的檸檬酸鹽緩沖液中進行。研究發現，隨著酵母自溶程度的增大，α-氨基氮、甲醛氮，溶液中大、中、小蛋白質分子含量都有所增加，其中，大、中分子蛋白質在總蛋白質中的比例呈現逐漸增大趨勢，而小分子蛋白質雖然含量增多，但所占比例呈現逐漸減小趨勢；而氣相色譜法測定游離脂肪酸的結果則表明，長鏈脂肪酸在酵母自溶過程中變化不明顯，且變化趨勢無規律可循。雖然上述部分實驗結果呈現一定的變化趨勢，但是個體差異明顯，且單一物質的變化不適合用于判定酵母自溶情況，所以無法將這幾個因素直接作為判定酵母自溶情況的指標。A260/A280常用來反映核酸類物質的純度，是一個綜合反映蛋白質與核酸類物質含量關系的物理量。而且酵母死亡率與自溶程度密切相關。本研究對A260/A280與酵母死亡率進行擬合，發現（A260/A280）/死亡率隨自溶程度的不同而呈現規律且一致的變化趨勢，即酵母菌株自溶程度越高，該比值越小。將實際自溶產物的 （A260/A280）/死亡率值與現有數據相比較，就可以得出酵母自溶的情況。該方法不僅可以用于判定同株酵母的自溶程度，還可用于比較不同菌株的自溶性能。因此，（A260/A280）/死亡率這一指標可用于選育自溶性能良好的啤酒酵母菌種用于工業生產，有助于預防酵母自溶給酒液帶來不良影響，并可以通過該標準對發酵后酵母泥中的酵母進行活性判定，以便于回收活性高的酵母用于下一批發酵。

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