3-氯-1,2-丙二醇對睪丸間質瘤細胞R2C生物活性的影響

鄒飛雁， 白 順， 白衛濱， 孫建霞， 張 磊， 黃亞東， 孫偉偉

（1.暨南大學 發育與再生生物學系，廣東 廣州 510632；2.暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；

3.廣東工業大學輕工化工學院，廣東廣州510090；4.暨南大學 醫藥生物技術研究開發中心，廣東廣州510632）

食品在加工貯藏過程中易受到氯丙醇污染。添加不合衛生條件的酸水解蛋白質液，容易引起醬油、蠔油等調味品含有氯丙醇[1]。近幾年在飲用水、發酵香腸、餅干、面包、燒煮魚、肉制品及膨化食品中檢出氯丙醇化合物[2]。此外，家庭烹飪熱加工也會導致食物中氯丙醇的產生，危害人體健康。氯丙醇污染及殘留已成為一個國際性食品安全問題，引起人們廣泛關注[3]。氯丙醇主要有3-氯1，2-丙二醇、1，3-二氯-2-丙醇、2，4-二氯-1-丙醇、2-氯-1，3-丙二醇等幾種同系物，其中3-氯1，2-丙二醇 （3-Monochloropropane-1，2-diol，3-MCPD）是最常見的氯丙醇類污染物之一。研究表明，氯丙醇具有一定的毒性作用，特別是3-MCPD，具有致癌性[4-5]。Sunahara[6]等人經過長期對大鼠的研究發現，喂食含3-MCPD的食物可能增加睪丸間質細胞瘤和乳腺癌的發病率，其具體的毒性機理目前還不明確，特別是體外的還未見相關報道。本研究通過3-MCPD對體外培養R2C細胞的毒性損傷情況，探討氯丙醇引起雄性生殖毒性的機制，為氯丙醇的食品安全評價提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 R2C細胞（大鼠睪丸間質瘤細胞株）:由暨南大學醫藥生物技術研究開發中心提供；3-MCPD:上海晶純公司；F12培養液、胰酶、胎牛血清、馬血清、肌氨酸鈉:美國Sigma公司；MTT、DMSO:美國 Amresco 公司；EDTANa2、Triton-X100、Tris:美國Genview公司；低熔點瓊脂糖:美國FMC公司；正常熔點瓊脂糖:西班牙Biowest公司；孕酮放免試劑盒:北京北方生物技術研究所。

1.1.2 儀器 CO2培養箱、酶標儀:美國Thermo公司；GC-1200γ放射免疫計數儀:安徽中科中佳公司；DDL-5低溫離心機:上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測3-MCPD對R2C細胞增殖的影響R2C細胞培養至對數期，調整細胞濃度為2×104個/mL，96孔板內每孔接種200 μL細胞懸液。24 h后加入用無血清培養液稀釋的3-MCPD溶液，使每孔終濃度分別為 0.5、1、2、4、6 mmol/L。 設有空白組 （無細胞）和對照組（無藥物），每組設3個復孔。藥物作用48 h 后，加入 20 μL、5 mg/mL 的 MTT。 作用 4 h 后吸去孔內液體，每孔加200 μL DMSO溶解沉淀，放于脫色搖床搖勻10 min后于酶標儀檢測570 nm波長處的吸光值[7]。通過以下公式及SPSS軟件分析3-MCPD 刺激細胞 48 h 后的 IC25、IC50、IC75。

細胞生長抑制率（%）=[1-（給藥組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%

1.2.2 單細胞電泳檢測3-MCPD對R2C細胞DNA損傷情況 調整對數期R2C細胞懸液的濃度為1×105個/mL，以每孔1 mL的細胞懸液接種到6孔板內。細胞培養24 h加入3-MCPD，使其終濃度為IC25、IC50和IC75。培養4 h后收獲細胞，4℃冷卻。

取0.8 g/dL正常熔點瓊脂糖，加熱熔化后，冷卻至45℃，取100 μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃、10 min 后取下蓋玻片。104個細胞與 75 μL、0.8 g/dL的低熔點瓊脂糖溶液在37℃下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10 min后取蓋玻片。玻片浸入預冷的裂解液 （2.5mol/LNaCl，100mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，1%Triton X 100 及 10%DMSO組成，臨用前配用，pH 10），4℃保持1 h。 取玻片，蒸餾水洗3次后，放入電泳槽，加電泳液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13），電泳液面需高出玻片0.25 cm，靜置20 min后于25 V、200 mA電泳15～20 min。取玻片置于 0.4 mol/L Tris（pH 7.5）溶液中洗滌 3次，每次10 min。避光滴加20 μL、25 μg/mL EB 染色， 蓋上蓋玻片后熒光顯微鏡下觀察拍照。CASP軟件分析電泳結果。

1.2.3 放射免疫法檢測3-MCPD對R2C細胞合成孕酮的影響 對數期R2C細胞懸液以1×106/mL的密度接種到6孔板，每孔1 mL，培養24 h后，換上分別含IC25、IC50和IC75濃度3-MCPD的培養液，繼續培養4 h或24 h后提取上清液，400 g離心5 min，-20℃保存。用放射免疫試劑盒檢測上清液中的孕酮含量。

1.2.4 統計學處理 運用SPSS軟件19.0進行統計分析，采用單因素方差分析結果，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3-MCPD對R2C細胞的生長抑制作用

不同濃度的3-MCPD作用R2C細胞48 h后，細胞生長受到不同程度的抑制。由圖1可見，隨著濃度的增加，細胞形態和數量均發生了變化。細胞形態逐漸變圓，且貼壁不穩定，隨著濃度的增加，此現象越明顯，同時細胞抑制率隨著3-MCPD濃度的增大也逐漸增大，見表1。通過SPSS軟件分析得出3-MCPD 對 R2C 細 胞 的 IC25、IC50、IC75分 別 為1.027、1.802、3.160 mmol/L。

圖1 不同濃度3-MCPD刺激R2C細胞48 h后的細胞形態圖（200×）Fig.1 Morphology ofR2C cells under different concentration of 3-MCPD for 48 h

表1 不同濃度3-MCPD對R2C細胞生長抑制率的影響Table 1 Inhibitory effect of 3-MCPD on R2C cells

2.2 3-MCPD對R2C細胞DNA損傷的作用

不同濃度3-MCPD刺激R2C細胞4 h后，細胞拖尾的長度隨著濃度的增加而增長，見圖2。通過CASP軟件分析尾部DNA%、尾長、尾距以及Olive尾距等數據得出，見圖3。IC75濃度組對細胞DNA有明顯的損傷作用，具有統計學意義，而其他組與對照組相比沒有顯著性的變化。

圖2 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對R2C細胞DNA損傷作用Fig.2 Damage of DNAs in R2C cells after treatment with 3-MCPD

圖3 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對R2C細胞尾部DNA%、尾長、Olive尾距的影響Fig.3 Effect of 3-MCPD on head DNA （%），tail length and olive tail moment in R2C cells

2.3 3-MCPD對R2C細胞分泌孕酮的影響

RIA結果顯示，不同濃度3-MCPD作用R2C細胞4 h后，IC75組能夠明顯影響細胞孕酮的合成，其他各濃度組與對照組相比對孕酮合成沒有顯著影響，見圖4。而在作用24 h后，可見孕酮合成量顯著降低，且隨著濃度的增加，降低也更明顯，見圖5。

圖4 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對R2C細胞孕酮合成的影響Fig.4 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 4 h

圖5 不同濃度3-MCPD刺激24 h后對R2C細胞孕酮合成的影響Fig.5 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 24 h

3 結語

生殖系統是氯丙醇主要的靶器官[8]，其中睪丸又是雄性生殖系統最主要的生殖腺。睪丸最主要的一個功能即睪丸間質細胞能夠產生雄激素睪酮，睪酮對維持正常的雄性生理功能起到至關重要的作用。

本研究首先發現了R2C細胞在3-MCPD的刺激下生長明顯受抑制，3-MCPD濃度在0～6 mmol/L范圍內，其抑制細胞增殖的作用為5.99%～96.87%，表明了3-MCPD可能是通過抑制R2C細胞的增殖來影響生殖系統的正常運行。體外實驗表明，3-MCPD及其代謝物縮水甘油對中國倉鼠卵巢細胞具有明顯的DNA損傷作用[9]。本研究的SCGE結果顯示， 濃度為 1.027、1.802、3.160 mmol/L 的 3-MCPD刺激R2C細胞4 h后，其中3.160 mmol/L刺激組，其尾部DNA%、尾長和Olive尾距分別增加342.6%、137.4%和409.7%，與對照組相比有統計學意義；而其余兩組與對照組相比無明顯統計學意義。這些結果顯示，3-MCPD對R2C細胞也具有一定程度的DNA損傷作用。孕酮是睪酮合成的第一步，通過檢測孕酮水平可間接說明睪酮的分泌量[10]。RIA的結果顯示，濃度為1.027、1.802、3.160 mmol/L的3-MCPD刺激R2C細胞4 h后，其中有3.160 mmol/L刺激組合成的孕酮與對照組相比降低了16.0%，有統計學意義。3-MCPD繼續作用細胞24 h后，各濃度組孕酮合成量與對照組相比分別降低9.5%、20.6%及61.2%，有統計學意義。

總之，3-MCPD對體外培養的R2C具有明顯抑制增殖和DNA損傷作用，并降低R2C細胞合成的孕酮，進而影響睪酮合成。通過以上結果推測，3-MCPD可通過影響R2C細胞孕酮合成過程相關基因的表達來調節孕酮合成。但大多數學者認為3-MCPD屬于非遺傳毒性致癌物，在體內小鼠骨髓微核和大鼠肝非程序性DNA合成試驗中，結果均為陰性[11]。目前對于體外試驗中3-MCPD具有遺傳毒性的解釋有兩種:一種認為3-MCPD在大鼠體內的主要代謝物為β-氯代乳酸，并沒有產生縮水甘油等其他具遺傳毒性的代謝物[4]；另一種認為3-MCPD能與體外的培養基中某些化合物反應，產物具有遺傳毒性作用[12]，其具體作用機制還需要進一步研究討論。

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