基于抑制非酶糖基化效果的金耳液體發酵

鄭俊麗 ， 陶冠軍 ， 彭 林 ， 丁重陽 *， 顧正華 ， 張 梁 ， 石貴陽

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；2.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇無錫214122；3.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

金耳（Tremella aurantialba）是一種重要的食藥用真菌，其子實體味道鮮美，營養豐富。現代藥理學研究表明，金耳多糖作為金耳的有效化學物質之一，具有降血糖[1]、抗腫瘤增強免疫[2]、抗氧化[3-4]等藥理作用。研究表明，金耳發酵液具有明顯的抑制非酶糖基化反應的活性[5]。所謂非酶糖基化反應，是指還原糖與體內蛋白質、氨基酸等的游離氨基端無需酶的催化，不可逆的以共價鍵結合形成結構多樣的聚合物的過程。它是引起糖尿病腎病[6]、白內障[7]和動脈粥樣硬化[8]等并發癥的主要因素之一。

目前，關于金耳的研究主要集中在多糖的分離提取、生物活性以及以多糖產率為指標的發酵條件優化等方面。作者以抑制非酶糖基化反應為指標，研究了培養基成分和培養條件對金耳發酵液抑制非酶糖基化反應的影響，并以此優化了發酵培養基和發酵條件；同時初步分析了金耳發酵液中抑制非酶糖基化反應的活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

金耳（Tremella aurantialba）菌株:由江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室保存；葡萄糖、蛋白胨、牛血清白蛋白:均購自國藥生化試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

斜面培養基 （組分g/L）:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂條 20～22。

種子培養基（組分g/L）:葡萄糖20，玉米粉20，麩皮 10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，VB1 15×10-3。

發酵基礎培養基（組分g/L）:葡萄糖20，麩皮10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1。

HITACHI 650-60熒光分光光度計:株式會社日立制作所；回轉式恒溫調速搖床:上海新星自動化控制設備成套廠；DRP-9082型電熱恒溫培養箱:上海森信實驗儀器有限公司；星海旋轉蒸發器:無錫市星海王生化設備有限公司。

1.2 方法

在優化碳源、氮源和復合營養源時，以基礎培養基作為對照進行優化；在考察無機鹽對發酵的影響時，以不加KH2PO4和MgSO4·7H2O的的基礎培養基作為對照。

1.2.1 液態發酵培養 在種子培養時，在250 mL三角瓶中加入80 mL種子培養基，滅菌后每瓶接入4塊0.5 cm2大小的活化菌種斜面，在25℃、150 r/min條件下培養144 h。在發酵培養時，將液態種子以5%的接種體積分數接種于裝有150 mL發酵基礎培養基的500 mL三角瓶中，在25℃、150 r/min條件下培養120 h。

1.2.2 碳源的優化 實驗中考察碳源為木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、微晶纖維素和甘露醇，分別以2 g/L考察碳源代替發酵基礎培養基中的葡萄糖，對照組為發酵基礎培養基。發酵結束后測定發酵液對非酶糖基化的抑制作用，每組設3個平行，取其平均值，根據抑制率確定最佳碳源。

1.2.3 氮源的優化 在基礎培養基中分別加入5 g/L酵母膏，蛋白胨，酪蛋白，氯化銨，硫酸銨，尿素，確定最佳氮源。

1.2.4 復合營養源的確定 用馬鈴薯和玉米粉分別代替發酵基礎培養基中的麩皮，另設不加任何復合營養源作為空白對照考察復合營養源對抑制非酶糖基化的影響，玉米粉和麩皮添加量10 g/L，馬鈴薯100 g/L，確定最佳復合營養源。

1.2.5 無機鹽的優化 在發酵基礎培養基中分別加 入 0.5 g/L 的 FeSO4，ZnSO4，CuSO4，MnSO4，Cr2O3，CaCl2，CoCl2，KH2PO4，MgSO4·7H2O 和 Na2MoO4，以確定最佳無機鹽。

1.2.6 正交試驗設計 根據單因素試驗結果，選用葡萄糖，蛋白胨，玉米粉與麩皮為影響因素，設計四因素三水平（L9（34））正交試驗。 基礎培養基為:0.5 g/L CoCl2，0.5 g/L MnSO4，裝液量 150 mL，接種體積分數5%，溫度25℃，150 r/min培養120 h。按表1進行正交試驗，每組試驗重復3次，測定發酵液對非酶糖基化反應的抑制率，分析確定抑制率最高的培養基配比。

1.2.7 溫度和起始pH的優化 金耳搖瓶試驗分別在 20、25、28、30、37 ℃條件下進行， 發酵結束后通過發酵液對非酶糖基化反應的抑制率確定最適溫度。在確定最適溫度的基礎上，分別用2 mol/L HCl和NaOH調整發酵基礎培養基的初始pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，接種后培養 120 h，確定最佳pH。

表 1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test of L9（34）

1.2.8 裝液量及接種體積分數的優化 500 mL三角瓶分別裝有 80、100、120、150、180 mL 發酵基礎培養基，pH調節至1.2.4確定的最佳pH，在最適溫度下培養120 h，確定最佳裝液量。將種子分別以5%、10%、15%、20%的接種體積分數接種到已確定的最佳裝液量的培養基中，在最佳初始pH、最適溫度下培養120 h后，測定發酵液對非酶糖基化反應的抑制率，確定最佳接種體積分數。

1.2.9 生物活性物質的提取 在優化培養基和培養條件下發酵得到的金耳發酵液，經8 000 r/min離心10 min除去菌體，向離心得到的發酵液中加入體積分數30%酒精，攪拌20 min后8 000 r/min離心5 min，除去蛋白質，離心后的上清液繼續加入酒精至體積分數70%，攪拌20 min后4℃冰箱靜置過夜。上清液除去酒精后，采用D101大孔樹脂脫色除雜得非多糖類粗品，4℃保存備用。沉淀加95%工業酒精洗滌3次，60℃烘箱烘干，得多糖粗品。粗多糖上DEAE離子交換柱，經蒸餾水洗脫后，用0～2 mol/L NaCl梯度洗脫，洗脫體積 300 mL，流速2 mL/min，自動部分收集儀收集洗脫液，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法檢測收集液吸光度，繪制洗脫曲線，并合并相應洗脫峰部分，主要吸收峰樣品冷凍干燥用于活性分析。

1.2.10 體外抑制非酶糖基化反應測定方法 所有搖瓶發酵液經離心，上清液定容至原發酵液體積供分析測定。測定方法參照文獻[9]進行適當修改，反應體系包含12 mg/mL乙二醛，10 mg/mL牛血清白蛋白，2 mg/mL疊氮化鈉以及0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）。測定中1 mL樣品液和1 mL反應液混合（對照組中由1 mL蒸餾水代替樣品液），混合液37℃反應15～17 d后，在激發波長370 nm，發射波長440 nm波長處測定熒光強度，重復三次，三次平均值計算抑制率。計算公式如下:

式中:I為抑制率；a為空白組熒光強度；b為樣品組熒光強度。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的優化

2.1.1 不同碳、氮源的確定 在真菌發酵過程中，培養基組成和培養條件是影響真菌生長及代謝產物合成的重要因素[10]。就發酵過程中所需碳氮源種類而言，不同菌株、不同目標產物對碳氮源的需求有明顯差別。王吉中等以產胞外多糖為目標，確定了云芝液體發酵培養的最優碳氮源分別為麥芽糖和多價胨[11]。劉艷芳[12]以生物量為主要指標確定了雞腿蘑搖瓶培養的最佳碳源為玉米粉和蔗糖，氮源為麩皮。董昌金等發現利于金耳菌絲體生長的最佳碳氮源分別為玉米粉和蛋白胨[13]。作者在考察碳源對抑制非酶糖基化反應的作用中發現，實驗中選用的不同碳源對于非酶糖基化的抑制作用影響較小，最高抑制率為對照組中選用的葡萄糖，抑制率達到52.81%，其他碳源均維持在40%左右（圖1a）。在考察的氮源中，發現無機氮源和有機氮源對非酶糖基化反應的影響具有較大差別（圖1b）。添加無機氮源后，非酶糖基化反應的抑制率對比未添加氮源有較大下降，而有機氮源則提升了金耳發酵液的抑制能力，其中蛋白胨的抑制率達到71.41%。通過碳源和氮源的優化，分別選定葡萄糖和蛋白胨作為培養基的碳源和氮源。

圖1 不同碳氮源對非酶糖基化反應抑制率的影響Fig.1 Effect of carbon and nitrogen resourceson inhibitory ratio of non-enzymatic glycosylation

2.1.2 不同復合營養源的確定 在考察的三種復合營養源中，發現對照組麩皮的抑制率最高，其抑制率為52.81%，玉米粉（47.94%）的抑制率雖低于麩皮，但相比無任何復合營養源組（18.31%），抑制率也有顯著提高，見圖2。因此選用麩皮和玉米粉作為復合營養源。

圖2 不同復合營養源及無機鹽對非酶糖基化反應抑制率的影響Fig.2 Effect of nutrition compolex source on inhibitory ratio of non-enzymatic glycosylation

麩皮和玉米粉作為復合營養源含有大量碳水化合物和多種維生素，為菌體生長提供碳源的同時又作為復合維生素增加菌絲的懸浮性，促進菌體生長，利于代謝產物的合成[14]。

2.1.3 無機鹽的確定 添加CoCl2和MnSO4能稍許提高抑制率 （抑制率分別為54.52%和55.73%），KH2PO4和Na2MoO4與未加無機鹽相比抑制率基本一致，而添加其他無機鹽后抑制率均明顯降低，見圖3。說明在金耳發酵培養基中添加無機鹽對非酶糖基化反應抑制率沒有顯著增強作用。在以后試驗中除補加CoCl2和MnSO4外不再補加其他無機鹽。

圖3 不同無機鹽對非酶糖基化反應抑制率的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on inhibitory ratio of nonenzymatic glycosylation

2.1.4 正交試驗及驗證實驗結果 金耳發酵培養基組分由正交試驗優化，結果見表2，試驗結果顯示，蛋白胨質量濃度極差最大，其次是玉米粉質量濃度，由此得出蛋白胨質量濃度對抑制率影響最大。結合均值分析后得出最佳培養基組成是A1B1C3D2，即最佳培養基組成為（g/L）:葡萄糖 10，蛋白胨 5，玉米粉 20，麩皮 15，CoCl20.5，MnSO40.5。在該條件下所得發酵液對非酶糖基化反應的理論抑制率為74.89%。經實驗驗證在此培養基組成條件下培養，發酵液對非酶糖基化反應的抑制率達75.82%，與理論值相符。

表2 優化培養基成分L9（34）正交試驗結果Tab.2 Orthogonal array design matrix and experimental results for optimizing fermentation medium

2.2 發酵條件優化

2.2.1 不同溫度及初始pH對非酶糖基化反應抑制率的影響 通過考察溫度對抑制率的影響時發現，在溫度為25℃時獲得最高抑制率75.93%，提高或降低培養溫度時會降低發酵液對非酶糖基化反應的抑制率（圖4a）。初始pH對抑制非酶糖基化反應的結果見圖4b。結果顯示，偏酸環境下發酵液對非酶糖基化的抑制作用較穩定，當pH小于6.5時，抑制率隨pH的升高而提高，pH 6.5左右時抑制率達到最大值82.20%；pH超過8.5時，抑制率呈明顯下降趨勢，當pH為9.5時，抑制率僅為43.04%。通過對溫度及pH的優化，分別選定25℃和pH 6.5為發酵溫度和培養基初始pH。

圖4 不同溫度及初始pH對非酶糖基化反應抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature and initial pH on inhibition ratio of non-enzymatic glycosylation

2.2.2 不同裝液量及接種量對非酶糖基化反應抑制率的影響 裝液量主要通過溶氧影響菌體生長及代謝產物的合成，進而導致抑制率的變化。通過對裝液量的考察發現，500 mL三角瓶裝液量150 mL時抑制率最高，增加或減少裝液量時抑制率略有下降。因此，裝液量對抑制率的影響較小（圖5a），在以后實驗中采用500 mL三角瓶裝液量150 mL。接種量的大小決定了菌種在發酵過程中的生長速度，采用大接種量有利于縮短生長延遲期，但過高的接種量使菌絲體迅速生長，消耗大量營養物質，反而影響后期的生長及代謝產物生成[15]。在考察接種量的實驗中發現，當接種量為10%時，抑制率最高（89.74%），接種量低于或高于10%時，抑制率均有所下降，尤其是接種量高于10%后，抑制率下降較明顯（圖5b）。所以在以后實驗中采用10%的接種量。

圖5 不同裝液量及接種體積分數對非酶糖基化反應抑制率的影響Fig.5 Effect of different volume medium and inoculum size on inhibition ratio of non-enzymatic glycosylation

2.3 金耳活性物質對非酶糖基化反應的抑制作用

分別稱取多糖和非多糖類粗品240 mg，溶于6 mL去離子水中，待完全溶解后取3 mL做兩倍稀釋，依次稀釋7次，分別測定不同濃度梯度的粗提物對非酶糖基化反應的抑制率，見圖6。

圖6 多糖和其他活性物質對非酶糖基化反應的抑制作用Fig.6 Effect of different concentration polysaccharides and non-polysaccharideson non-enzymatic glycosylation in vitro

結果顯示，多糖和非多糖類物質對體外非酶糖基化反應均有抑制作用，其中多糖類物質對非酶糖基化抑制作用的半抑制率質量濃度IC50為7.15mg/mL，而非多糖類物質為4.26 mg/mL。這說明在金耳發酵液中多糖和其它非多糖類物質對抑制非酶糖基化反應起共同抑制作用，并且以非多糖類物質為主。

藥用真菌作為藥物資源豐富，目前已開發的藥用真菌主要以多糖成分為主，而藥用真菌除含有多糖外還含有生物堿、甾醇類和萜類等化合物。研究表明，靈芝中萜類化合物活性高，可以降血糖，降低血壓，而樟芝對晚期癌癥有較好的療效主要也是萜類化合物起作用[16]。Kim等研究發現，姬松茸中的β-葡聚糖和寡糖均能使糖尿病小鼠的血糖水平顯著下降，其中寡糖的功效最為明顯[17]。目前為止，關于金耳代謝物的研究，張志才曾報道了金耳粗提物（TBE，非多糖類小相對分子質量物質，具體結構尚不清楚。）對非酶糖基化反應有抑制作用[18]；有研究者從金耳子實體中分離出一個對稱結構 （金耳素）[19]，關于其抑制非酶糖基化方面的生物學功能還沒有報道。本研究發現金耳多糖和非多糖類物質對非酶糖基化反應均有抑制作用。金耳多糖的研究主要集中在降血糖，降血脂，抗氧化等方面，其抑制非酶糖基化方面卻鮮有報道。非多糖類粗品中具有抑制非酶糖基化作用的物質可能也是某種寡糖或萜類物質。

3 結語

作者以抑制非酶糖基化為檢測平臺，通過單因素和正交試驗，確定了培養基成分:葡萄糖10 g/L，蛋白胨 5 g/L，玉米粉 20 g/L，麩皮 15 g/L，CoCl20.5 g/L，MnSO40.5 g/L。在優化培養基的基礎上通過單因素試驗得出最佳培養條件為:培養溫度25℃，初始pH 6.5，500 mL三角瓶裝液量150 mL，接種體積分數10%，優化后的抑制率達89.74%，是基礎培養基的1.7倍。

通過對金耳發酵液抑制非酶糖基化的物質的初步分析，發現除多糖外可能還含有某種寡糖或萜類物質具有抑制非酶糖基化的作用，具體的化學結構正在進一步研究中。

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