竹黃菌固態發酵產竹紅菌素條件的優化

呂騰飛 ， 丁彥蕊 ， 廖祥儒 ， 蔡宇杰 *

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 物聯網工程學院，江蘇 無錫214122）

竹黃（Shiraia bambusicola），俗稱竹花，赤團子，竹赤團子等[1]，屬于子囊菌亞門中的核菌綱、球殼目、肉座菌科（Hypocreaceae）、竹黃屬（Sharaia）。 竹黃主要寄主為箭竹屬和短穗竹屬植物，主要分布在江西、浙江、江蘇、湖北、湖南、安徽、貴州和云南等地，以及亞洲的日本[2]。是一種特異性寄生在某些竹子嫩枝上的藥用真菌，藥用部分為其子座，具有止咳祛痛、舒筋活絡、祛風利濕等功效，可用于風濕性關節炎、坐骨神經痛、急性肝炎等[3]，在民間常用其泡酒，用以治療跌打損傷、虛寒胃痛等癥[4-5]。竹紅菌素被認為是竹黃中主要的有效成分之一，由多種苝醌類衍生物組成[6-7]。近年來發現竹紅菌素具有優良的光敏殺傷腫瘤細胞和抑制艾滋病病毒的作用，并且是一種新型的光活化農藥和潛在的光電轉化材料，在世界范圍內正被廣泛的研究[8]。

從竹黃子座中直接提取獲得竹紅菌素的技術在國內外都有報道[9]，然而竹黃野外采集資源有限，而且容易造成竹林衰敗。近年來，通過液態發酵和固態發酵的方法獲得竹紅菌素取得了一定的進展[10-11]。項曉燕等（2012）通過優化竹紅菌素的液態發酵條件，色素產量達到了7.68 mg/g菌體[12]；蔡宇杰等（2004）利用固態發酵生物合成竹紅菌素，色素產量達到了40 mg/kg培養基[9]，為解決竹紅菌素的來源提供了新思路。

相較于液態發酵，固態發酵具有節水節能的獨特優勢，而且幾乎沒有廢液排放，屬于清潔生產技術，在發酵領域日益受到重視[13]。作者采用固態發酵的方法，研究了培養基組成、種齡、接種量、初始含水量和溫度等對竹紅菌素產量的影響，以期能為規?；a提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

竹黃菌 （Shiraia bambusicola）SUPER-H168:作者所在實驗室保藏。

1.2 培養基

斜面培養基（g/dL）:馬鈴薯 20，葡萄糖 2，瓊脂2；pH 自然。

種子培養基 （g/dL）:馬鈴薯 20， 葡萄糖 2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；pH 自然。

基礎培養基:玉米（顆粒度 18～16目）25 g，麥秸稈（20 目）5 g，蒸餾水 30 mL，pH 自然。

上述培養基均在121℃下滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備 斜面種子于30℃培養5～7 d至長出大量孢子，用20 mL無菌水洗下孢子，玻璃珠將孢子充分打碎，配置成106個/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 色素檢測方法 將固態培養物于烘箱中70℃烘干至恒重，準確稱取1.00 g，研缽研碎，用30 mL無水乙醇在30℃條件下提取兩次，每次40 min，抽濾后得澄清液，用旋蒸儀蒸發干，甲醇溶解并適當稀釋后，用分光光度計在465 nm處測定其吸光值[14]，根據回歸方程 y=0.036 4x+0.044 1（R2=0.999）計算色素的含量，其中y為吸光度值，x為色素質量濃度（mg/L）。

1.3.3 玉米顆粒度和麥秸稈添加量的優化 選擇不同的玉米粒徑和麥秸稈添加量進行組合實驗，以確定最佳的配比。

1.3.4 初始含水量的優化 選擇初始含水量在35%～70%的各個水平，通過實驗確定最適含水量。

1.3.5 培養溫度的優化 固態發酵培養基接種后，分別在 24、26、28、30、32 ℃條件下培養，以確定最佳培養溫度。

1.3.6 種齡的優化 接種1.3.1所述孢子懸液2 mL于50 mL種子培養基中，在30℃、200 r/min分別振蕩培養 12，24，36，48，72 h 作為固態發酵的種子液。

1.3.7 接種量的優化 每30 g固態發酵基質（以干重計）分別接種 1、2、3、4、5 mL 液體種子，以確定最佳的接種量。

1.3.8 外加碳、氮源以及無機鹽的優化 以葡萄糖為 外 加 碳 源 ，NH4Cl 為 外 加 氮 源 ，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4為無機鹽， 按照表 1設計 7因素3水平正交實驗。

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal design

2 結果及分析

2.1 玉米顆粒度和麥秸量的優化

固態發酵中加入麥秸粉末有助于改善氧氣和熱量的傳遞情況，并且能使培養基蓬松，為菌絲體的生長提供良好的條件；但是麥秸量太多，在培養基制備過程中就會吸收更多的水分，而分配在玉米顆粒上的水分減少，使玉米顆粒在蒸料過程中不能充分糊化，從而影響菌體的生長。玉米顆粒度過小，導致培養基在蒸料過程中容易結塊，而顆粒度太大，又會影響菌體對玉米顆粒內部營養物質的利用，實驗結果見表2。當麥秸的添加量為3 g，玉米的顆粒度為0.78～0.95 mm時，色素的產量最高，達1.42%（色素含量占培養基干重，下同）。

表2 玉米顆粒度和麥秸稈量對色素產量的影響Table 2 Effect of straw powder and maize grits on yield of pigment

2.2 初始含水量的優化

含水量是影響固態發酵的主要因素之一，從圖1可知，含水量為50%時色素的產量最高，可達0.93%。

圖1 初始含水量對色素產量的影響Fig.1 Effect of moisture content of beads on yieldof pigment

2.3 溫度的優化

由圖2可知，培養溫度為30℃時，色素的產量最高，達1.09%。當溫度低于28℃時，不僅最終的色素產量會下降，色素的合成時間也會推遲。 故選擇30℃為最佳培養溫度。

2.4 種齡的優化

種齡對種子的活性和種子的濃度都有較大的影響。種齡過短，則大部分菌體尚處在適應期，此時接種會延長前期菌體的生長時間；種齡過長，則菌體開始進入衰亡階段，種子的活力也會急速下降，影響后期的發酵。由圖3可知，當種齡為24 h時，色素的產量最高，達到1.44%。種齡超過24 h，色素的產量會迅速下降。

圖2 溫度對色素產量的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of pigment

圖3 種齡對色素產量的影響Fig.3 Effect of seed age on yield of pigment

2.5 接種量的優化

合適的接種量能縮短發酵周期，提高色素的產量。由圖4可知，當接種量達到2 mL/30 g干重時，色素的產量達到1.66%。接種量繼續提高，色素的產量會出現下降的趨勢，因此選擇2 mL/30 g干重為最佳的接種量。

圖4 接種量對色素產量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount of beads on yield of pigment

2.6 外加碳源、氮源及無機鹽的優化

以葡萄糖為外加碳源，NH4Cl為外加氮源，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4為 無 機 鹽 ， 按照表2設計7因素三水平正交實驗，以確定各組分的質量分數及配比，結果見表3～4。

表3 實驗數據及結果Table 3 Data and results of orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Tests of Between-Subjects Effects

表3表明，在各因素中，CaCl2的極差最大，其次 是 Glucose，KH2PO4，K2HPO4和 CuSO4，MgSO4； 而NH4Cl的極差最小。因此各因素的主次順序為:CaCl2＞Glucose ＞KH2PO4＞CuSO4＞K2HPO4＞MgSO4＞NH4Cl。最佳的碳氮源及無機鹽配比為:Glucose 5%，NH4Cl 1% ，CuSO40.05% ，CaCl20.10% ，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%。

表 4 方 差 分 析 表 明 ，Glucose，CuSO4，CaCl2，KH2PO4以及K2HPO4等五個因素在95%的置信度下對色素產量的影響都是顯著的。

3 結語

作者通過對竹黃菌固態發酵產竹紅菌素條件的研究，確定了適宜的培養基的成分和培養條件。最佳培養基配方及培養條件為:玉米顆粒度0.78～0.95 mm，麥秸添加量 10%，Glucose 5%，NH4Cl 1%，CuSO40.05%，CaCl20.10%，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%，初始含水量50%，培養溫度30℃，種齡24 h，接種量2 mL/30 g干重，優化后竹紅菌素產量達1.66%（占培養基干重）。在本實驗中，發酵周期長達15 d，因此，有必要對發酵條件和過程做進一步優化，以期縮短發酵時間。

[1]劉天慧.食用菌概論[M].北京:中國展望出版社，1987:26.

[2]梁曉輝，蔡宇杰，廖祥儒，等.竹黃菌絲與竹黃子座成分比較分析[J].食品與生物技術學報，2009，28（5）:705-708.LIANG Xiao-hui，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Analysis of the chemical compositions of Shiraia sp.SUPER—H168 fermented mycelia and the stromata of Shiraia bambusicola[J].Joumal of Food Science and Biotechnology，2009，28（5）:705-708.（in Chinese）

[3]林海萍，陳聲明，陳超龍，等.一種值得開發利用的藥用真菌—竹黃[J].浙江林業科技，2002（22）:78.LIN Hai-ping，CHEN Sheng-ming，CHEN Chao-long，et al.Shiraia bambusicola，a medicinal fungi needed to be developed[J].Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology，2002（22）:78.（in Chinese）

[4]鐘樹榮，趙海，李安明，等.一種尚待開發的中藥-竹黃[J].中草藥，2002，33（4）:372-374.ZHONG Shu-rong，ZHAO Hai，LI An-ming，et al.Potential TCM-Shiraia bambusicola[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2002，33（4）:372-374.（in Chinese）

[5]梁曉輝，蔡宇杰，廖祥儒，等.藥用真菌竹黃的研究進展[J].食品與生物技術學報，2008，27（5）:22-26.LIANG Xiao-hui，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.The progress of research on medicinal fungus shiraia bambusicola[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2008，27（5）:22-26.（in Chinese）

[6]蔣莉金，何玉英.竹紅菌素類光敏劑的光物理、光化學及光生物[J].科學通報，2000，（45）19:2019-2033.JIANG li-jin，HE yu-ying.Photophysical，photochemisical and photobiological properties of hypocrellin[J].Chinese Science Bulletin，2000，（45）19:2019-2033.（in Chinese）

[7]王秀麗，孫振令，劉為忠，等.四種苝醌類光敏劑活性的比較[J].山東理工大學學報:自然科學版，2003，17（5）:21-24.WANG Xui-li，SUN Zhen-ling，LIU Wei-zhong，et al.Comparison between photosensitive activities of four perylenequinonoid derivatives[J].Journal of Shandong University of Technology:Natural Science Edition，2003，17（5）:21-24.（in Chinese）

[8]張儉，馬嵐.竹紅菌素研究的進展[J].云南大學學報:自然科學版，2003，25（增刊）:184-188.ZHANG jian，MA lan.Recent advances of hypocrellin research[J].Journal of Yunnan University:Natural Sciences，2003，25（supplement）:184-188.（in Chinese）

[9]林海萍，陳虹，葉勇，等.竹黃竹紅菌素含量的測定方法[J].浙江林學院學報，2002（12）:57.LIN Hai-ping，CHEN Hong，YE Yong，et al.Determining method for content of hypocrellin A in Shiraia bambusicola[J].Journal of Zhejiang Forestry College，2002（12）:57.（in Chinese）

[10]蔡宇杰，丁彥蕊，張大兵，等.竹黃菌的固態發酵竹紅菌素的研究[J].生物技術，2004，14（4）:46-47.CAI Yu-jie，DING Yan-rui，ZHANG Da-bing，et al.Study on fermentation hypocrellin pigments by shiraia bambusicola henn.under solid condition[J].Biotechnology，2004，14（4）:46-47.（in Chinese）

[11]胡明明，蔡宇杰，廖祥儒，等.竹紅菌素培養基的初步優化[J].食品與機械，2010，26（5）:141-143.HU Ming-ming，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Optimization on submerged fermentation media of hypocrellin[J].Food&Machinery，2010，26（5）:141-143.（in Chinese）

[12]項小燕，張中信.竹黃菌液體培養條件下產竹紅菌素的研究[J].廣西植物，2012，32（2）:264-268.XIANG Xiao-yan，ZHANG Zhong-xin.Study on fermentation hypocrellin by Shiraia bambusicola in submerged cultures[J].Guihaia，2012，32（2）:264-268.（in Chinese）

[13]黃達明，吳其飛，陸建明，等.固態發酵技術及其研究的進展[J].食品與發酵工業，2003，29（6）:87-91.HUANG Da-ming，WU Qi-fei，LU Jian-ming，et al.Current research progress of solid state fermentation technology and equipment[J].Food and Fermentation Industries，2003，29（6）:87-91.（in Chinese）

[14]劉為忠，李聰，陳遠騰，等.苝醌類化合物總量的測定[J].云南化工，2000，27（2）:35-37.LIU Wei-zhong，LI Cong，CHEN Yuan-teng，et al.Determination of the total quantity of perylene quinonoids[J].Yunnan Chemical Technology，2000，27（2）:35-37.（in Chinese）