酶聯免疫吸附法檢測動物源性食品中氨苯砜殘留

陶光燦， 李 勇， 崔廷婷， 王 嬌， 扶 勝

（北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206）

氨苯砜（dapsone，DDS）為砜類抑菌劑，對麻風桿菌有較強的抑菌作用，大劑量使用時顯示殺菌作用[1]。由于其作用機制與磺胺類藥物相似，兩者具有協同增效作用，在動物和水產養殖中常作為磺胺增效劑使用[2]。然而氨苯砜毒性較大，可引起血液系統反應，如高鐵血紅蛋白血癥和溶血性貧血，還可能出現肝腎功能損害和精神障礙[1，3]，因此我國農業部235號公告明確規定禁止在所有食品動物中使用，且在動物性食品中不得檢出[4]；歐盟2377/90也明確規定氨苯砜為禁用藥物[2]。

目前，國內外關于食品中氨苯砜殘留檢測的報道較少，且多與磺胺類藥物同時檢測，方法主要為高效液相色譜法[5-6]和液質聯用法[2，7-8]，儀器方法可以精確地進行定量分析，但設備昂貴、操作復雜、對樣品純度要求較高、檢測成本高、周期長，只能用于小批量樣本抽檢，無法滿足食品安全檢測中對大批量樣本現場快速篩查的需要[9]。而酶聯免疫吸附技術（ELISA）具有特異性高、敏感性強、快速方便、不需要昂貴儀器設備、檢測成本低、適合于大批量樣品的檢測等優點，已在農獸藥殘留及微量毒素檢測中被廣泛應用，但目前尚未見該技術在動物源性食品中氨苯砜殘留檢測中應用的報道。因此，作者在利用合成的氨苯砜人工抗原，通過細胞融合技術制備出DDS單克隆抗體的基礎上，建立了動物源性食品中氨苯砜殘留的間接競爭酶聯免疫吸附法，為商品化試劑盒的研制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨苯砜（純度≥99%）、琥珀酸酐、吡啶、二甲基亞砜、碳化二亞胺、N，N-二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）:Sigma公司產品；其他常規化學試劑均為分析純:北京化學試劑公司產品；復溶工作液:pH 7.6，含質量分數8%～12%酪蛋白、0.1～0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設備

8010S勻漿機:上海斯伯明儀器設備有限公司產品；2000SBL電子天平:美國Setra公司產品；KS-Ⅱ振蕩器:上海躍進醫療器械廠產品；QL-901漩渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品；Anke TDL-40B低速離心機:上海安亭科學儀器有限公司產品；DSY-Ⅲ氮吹儀:北京金科精華苑科技有限公司產品；微量移液器（單道 20～200 μL、100～1 000 μL，多道 20～300 μL）:美國 Thermo 公司產品；DHP-600生化培養箱:天津市中環實驗電爐有限公司產品；MK3酶標儀:美國Thermo公司產品。

1.3 方法

1.3.1 氨苯砜半抗原的合成 0.50 g氨苯砜、0.40 g琥珀酸酐和2 mL吡啶在10 mL二甲基亞砜中混合，在60℃下攪拌反應10 h，蒸除溶劑，柱層析后在乙醇-水體系中重結晶得到氨苯砜單琥珀酸酰胺，即為氨苯砜半抗原。

1.3.2 氨苯砜人工抗原的制備及鑒定

1）氨苯砜免疫原的制備 取氨苯砜半抗原12 mg用1.5 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液Ⅰ；取質量分數50%的戊二醛10 μL加入溶液Ⅰ中，室溫下攪拌反應18 h，得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白60 mg用4.5 mL水稀釋后加入溶液Ⅱ中，反應過夜后加入24 mg NaBH4反應3 h，用三蒸水透析48 h，即得氨苯砜免疫原。

2）氨苯砜包被原的制備 取碳化二亞胺50 mg用2 mL水使之充分溶解，得到溶液A；取氨苯砜半抗原13 mg用1 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液B；取卵清蛋白30 mg溶于2 mL 0.01 mol/L PBS（pH=8.0）溶液中，得到溶液C；將B液與C液混合，在磁力攪拌下逐滴加入A液中，室溫下攪拌反應24 h，用三蒸水透析48 h，即得氨苯砜包被原。

3）人工抗原的鑒定及偶聯比測定 采用TNBS方法[10]初步鑒定了人工抗原的合成情況，并測定了氨苯砜半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶聯比。

1.3.3 單克隆抗體的制備 用150 μg的氨苯砜免疫原與等量弗氏完全佐劑（FCA）混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射。二免和三免時，將FCA換成弗氏不完全佐劑（FIA），劑量和方法同上，每次免疫間隔時間為2周，三免后第7 d，小鼠尾部靜脈采血，室溫靜置1 h，4℃過夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4℃保存，用間接ELISA法測定血清效價，待效價較高時，按照150 μg/只的劑量腹腔注射加強免疫。3 d后取小鼠脾臟進行細胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規方法制備腹水抗體[11]，用飽和硫酸銨法純化后備用。

1.3.4 酶聯免疫方法的建立

1）抗原抗體最佳工作濃度的確定 采用方陣滴定法確定包被抗原 （氨苯砜半抗原-卵清蛋白偶聯物）與單克隆抗體的最佳工作濃度。每孔加入100 μL最佳工作濃度的包被原包被酶標板，37℃溫育2 h；傾去包被液，經PBST洗滌液洗滌3次，用封閉液37℃條件下封閉2 h，洗滌3次，干燥備用。向包被有包被原的酶標板微孔中加入氨苯砜標準品溶液50 μL，隨機加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體溶液50 μL，再加入最佳工作濃度的單克隆抗體溶液 50 μL，用蓋板膜封板，25℃反應 30 min，用洗滌液洗滌4～5次。每孔再加入底物液A液（過氧化脲）和 B 液（四甲基聯苯胺）各 50 μL/孔，25 ℃顯色 15 min后每孔加入 50 μL 2 mol/L H2SO4終止液，設定酶標儀于450 nm處測定每孔吸光度值。

2）標準曲線的制作 采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇標準品質量濃度0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L，以質量濃度為 0 μg/L 時的OD值為B0值，其它濃度氨苯砜標準品的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 樣本前處理方法的建立

1）雞肉、豬肉前處理方法 稱取（2.0±0.05）g樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入7.5 mL乙腈和 0.5 mL 水，振蕩 2 min，4 000 r/min 室溫（20～25℃）離心5 min；取出2 mL上層有機相至10 mL干凈的玻璃試管中，50℃下氮氣吹干或旋轉蒸發儀蒸干；加入1 mL正己烷，渦動30 s，再加入1 mL復溶工作液，渦動 30 s；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min 離心5 min；除去上層有機相，取下層50 μL用于分析。

2）雞蛋、蜂蜜前處理方法 稱取（1.0±0.05）g樣本至10 mL離心管中；加入4 mL去離子水，振蕩30 s，取上層清液200 μL加入600 μL復溶工作液混勻；取50 μL用于分析。

3）牛奶前處理方法 取100 μL樣本至2 mL離心管，加入 500 μL 復溶工作液，混勻；取 50 μL用于分析。

1.3.6 酶聯免疫方法技術參數的確定

1）樣本檢測限試驗 取空白樣本20份，按1.3.4所述方法前處理后進行ELISA檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光度值的氨苯砜濃度，以20份樣本的質量分數平均值（）和標準差（S）表示檢測限（MDL），即 MDL=+3S。

2）準確度和精密度試驗 以3個不同質量分數的氨苯砜標準品分別對空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行添加回收試驗，計算回收率和變異系數。

式中:CX為添加了一定氨苯砜的樣本經過標準曲線分析得到的實際質量分數，μg/kg；C0為空白樣本經過標準曲線分析得到的實際質量分數，μg/kg；C為實際添加的氨苯砜質量分數，μg/kg。

3）穩定性試驗 將酶聯免疫方法相關的試劑組裝成試劑盒后，取足量保存于37℃環境中，每隔1 d取出適量，分別測定零標準品的OD值、半數抑制濃度（IC50），及按2）所述方法進行添加回收試驗所測得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止，根據試驗結果判斷試劑盒的穩定性。

4）可靠性試驗 隨機抽取雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本各20份，用本方法與標準方法《SN/T 2219—2008進出口動物源性食品中氨苯砜及其代謝產物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（對雞肉、豬肉、雞蛋和牛奶中氨苯砜的測定低限為0.5 μg/kg）[12]和《GB/T 22940—2008 蜂蜜中氨苯砜殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（方法檢出限為2.0 μg/kg）[13]分別對其進行檢測，根據試驗結果驗證ELISA方法檢測實際樣本的有效性。

2 結果與分析

2.1 氨苯砜半抗原與載體蛋白偶聯比的測定

通過TNBS法證明偶聯反應是成功的，并測得半抗原與BSA的偶聯結合比為10.45∶1，與OVA的偶聯結合比為7.28∶1。TNBS能特異性地與蛋白質分子上的自由氨基結合，專一性比較強，對儀器要求更低，操作也較簡單。

2.2 最佳工作質量濃度的選擇

方陣法測定不同包被原和單克隆抗體的間接競爭抑制ELISA測定結果 （A450nm值）見表1。在ELISA包被過程中，包被效果與濃度呈正相關，但濃度過高，不僅浪費試劑，而且會降低待測物的競爭能力，從而影響曲線靈敏度[14]。考慮到酶標儀測定OD450nm值的敏感范圍在1.00左右，為了既保證測定結果的靈敏可靠，又減少抗原的用量，試驗應選擇的最適包被原稀釋倍數為1∶40 000，最佳抗體稀釋倍數為 1∶100 000。

2.3 標準曲線的建立

根據建議的間接競爭ELISA方法，選擇氨苯砜標準品質量濃度 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L， 以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標（Y），標準品質量濃度的對數值為橫坐標（X）繪制標準曲線如圖1。以lg（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，將圖1轉換后可知，在0.1～8.1 μg/L質量濃度范圍內，lg（B/B0）與氨苯砜濃度對數呈現良好的線性關系（圖 2）， 得回歸方程 Y=-2.492 6X-0.982 4，R2=0.995 6，IC50為 0.369 μg/L。

圖1 氨苯砜的標準曲線Fig.1 Calibration curve of dapsone by ELISA

圖2 氨苯砜的檢測標準曲線Fig.2 Calibration curve for detection of dapsone by ELISA

2.4 樣本檢測限

一定條件下，ELISA方法檢測限（MDL）符合正態分布的規律[15]，因此用20個空白樣本通過ELISA測定的光密度在標準曲線上對應的氨苯砜濃度的平均值（）和標準差（S）來表示，即 MDL=+3S，結果見表2。綜合考慮幾種樣本的檢測限數據，得本方法對雞肉、豬肉樣本的檢測限為0.2 μg/kg，對雞蛋、蜂蜜樣本的檢測限為2 μg/kg，對牛奶樣本的檢測限為 0.6 μg/L。

表2 酶聯免疫方法對不同樣本的檢測限Table 2 Detection limit for different samples of ELISA

2.5 準確度和精密度

ELISA測定的準確度以回收率表示，精密度以變異系數表示。取空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本，按表3所述的氨苯砜添加質量分數對其進行添加回收試驗，每個質量分數做5個平行，用3個批次的產品測定，分別計算回收率和批內、批間變異系數，結果見表3。

表3 酶聯免疫方法的準確度和精密度Table 3 Accuracy and precision of ELISA

由表3可知，以3個不同質量分數的氨苯砜標準品對空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行添加，其加標回收率范圍為78.2%～104.0%，說明方法準確度較好；批內變異系數范圍為5.2%～11.4%，批間變異系數范圍為7.4%～13.5%，均小于15%，說明方法精密度（重復性）較好。

2.6 穩定性試驗

將ELISA方法涉及到的各種試劑組裝成試劑盒后在37℃條件下存放，每隔1 d取出，測定靈敏度和回收率等參數，結果見表4。經測定，該試劑盒能在37℃條件下穩定保存9 d，第10 d開始各項參數下降。根據生化試劑在37℃每穩定1 d，相當于4～10℃保存一個半月[16]，可知，試劑盒可在4℃下至少穩定保存12個月。

表4 酶聯免疫試劑盒穩定性測定Table 4 Stability of the ELISA kit

2.7 可靠性驗證

通過ELISA方法和儀器方法對隨機抽取的雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行測定，雞肉、豬肉樣本的陽性判定線為0.5 μg/kg，雞蛋、蜂蜜樣本的陽性判定線為2 μg/kg，牛奶樣本的陽性判定線為0.6 μg/L，結果篩選出7份陽性樣本，比較結果見表5。

表5 ELISA法和LC-MS/MS法檢測結果比較Table 5 Comparison determination results of ELISA with LC-MS/MS

由表5可知，用ELISA法和LC-MS/MS法的測定結果基本一致，符合度達到100%，適用于動物源性食品中氨苯砜殘留的篩選。

3 結語

氨苯砜（DDS）為小分子物質，不具備免疫原性，只有反應原性，因此需要與一大分子物質共價結合后才能使動物免疫系統識別，產生相應的抗體。合成免疫抗原通常采用小分子物質與載體蛋白直接偶聯的方法，但是由于DDS相對分子質量較小，含有的可反應基團較少，使與載體蛋白偶聯上的可能性大大降低；同時其結構簡單，與載體蛋白偶聯后由于缺少間接臂，可能影響DDS與抗體的特異性識別。因此，本研究先對DDS小分子物質進行結構改造，在保留其基本結構特征的基礎上引入一定長度的間接臂，然后再與蛋白偶聯，可以制備得到較高偶聯比的人工抗原，在免疫時更易誘發產生特異性抗體。

目前，用高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法檢測食品中氨苯砜的定量下限多在0.12～5 μg/kg。作者建立的檢測方法的半數抑制濃度 （IC50）為0.369 μg/L，對雞肉、豬肉樣本的檢測限為0.2 μg/kg，對雞蛋、蜂蜜樣本的檢測限為2 μg/kg，對牛奶樣本的檢測限為0.6 μg/L，與儀器方法相比，靈敏度較低。但由于ELISA方法對儀器、樣品純度和技術人員的要求不高，操作簡便，檢測時間短（45 min）、成本低，適合于大量樣本中氨苯砜殘留檢測的快速篩選，能夠更好地滿足我國基層檢測單位、政府職能監管部門等開展檢測工作，具有較好的應用前景。

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