抗氧化肽的構效關系研究進展

張 暉 ， 唐文婷 ，2， 王 立 ， 錢海峰 ， 齊希光

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122；2.青島農業大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

生物活性肽（Bioactive Peptides）是對生命體的生命活動具有積極作用、并最終影響機體健康的特殊蛋白片段。抗氧化肽（Antioxidative Peptides）是目前國內外研究較多的一種生物活性肽，具有抑制、延緩脂質氧化，保護人體組織器官免受自由基侵害的作用。生物體內的氧化損傷可改變細胞的結構和功能，進而影響機體健康。食品、飼料加工中發生的脂質過氧化易破壞食品營養價值，甚至誘發疾病。食品工業中廣泛應用的化學合成抗氧化劑如BHA、BHT，抗氧化效果良好，但長期食用對人體具有一定的潛在毒性。食源性蛋白質通過水解作用得到的抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性強和易被吸收等特點[1-3]，因此在食品、制藥和化妝品行業中具有極大的潛在利用價值。已有研究者從發酵乳[4]、大豆[5-6]、乳清[7]、玉米[8]、雞蛋[9]和魚[10]中制備得到抗氧化肽。盡管其體內抗氧化性的研究報道較少，但目前的體外研究表明這些食源性抗氧化肽在人體和食品中具有極大的抗氧化潛勢。

目前抗氧化肽的相關研究主要集中于從蛋白酶解物中分離、純化得到抗氧化肽，并分析氨基酸的組成、肽序等，雖有一些涉及到抗氧化肽活性位點、一級結構與功能方面的研究，但其分子機制、抗氧化機理尚未徹底闡明。而探明抗氧化肽的構效關系，揭示其抗氧化機理，對于抗氧化肽的開發使用具有重要的意義。作者綜述了已報道的不同來源的抗氧化肽的氨基酸組成和排列特點、可能的活性位點和抗氧化機制，以及目前主要的研究抗氧化肽構效關系的方法。

1 抗氧化肽構效關系

大部分研究者認為，抗氧化肽通常包含特定類型的氨基酸，氨基酸的種類、序列、構型決定著其抗氧化能力。

1.1 氨基酸組成對抗氧化肽活性的影響

表1中列出了近年來國內外一些研究者通過蛋白質水解法制得的抗氧化肽的來源、評價方法、氨基酸的組成與序列。這些已知序列的抗氧化肽相對分子質量大多在500～1 800，氨基酸序列間幾乎無同源性。因采用的原料、酶、制備條件不同，抗氧化肽的氨基酸組成、肽序、結構等有差異，最終導致抗氧化肽的活性強弱不同。大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、 His、Tyr、Trp 和 Cys等氨基酸。疏水性氨基酸的脂肪烴側鏈使抗氧化肽與多不飽和脂肪酸的相互作用增強，或易于與自由基結合，從而抑制脂質過氧化反應[11]。His的抗氧化作用在于其金屬螯合能力[11]。芳香族氨基酸 Trp、Tyr可通過供氫[12]、Cys 可通過供電子發揮抗氧化作用[13]。

1.2 一級結構對抗氧化肽活性的影響

研究者普遍認為抗氧化肽的N端為疏水性氨基酸。但表1中也有例外，如有的抗氧化肽N端為Asn、Tyr和His。此外，也有研究者認為抗氧化肽的C端須為親水性氨基酸，氨基酸排列順序的變化也會影響肽的活性。

Chen等人[34]通過研究28種合成肽的抗氧化活性發現肽中C端缺失His則會降低抗氧化活性，N端缺失Leu卻對抗氧化活性無影響，同時他們認為合成肽與非肽抗氧化劑具有協同作用，但與肽本身的抗氧化性無關。Tsuge等人[14]研究雞蛋清蛋白水解物AHK時，發現C端Lys的缺失對活性無影響。Mendis等[35]通過水解鱈魚皮膠原蛋白得到抗氧化肽HGPLGPL，并推斷N端His、C端Leu對肽的高抗氧化活性具有重要貢獻。Guo等人[27]采用protease N水解蜂王漿蛋白得到29種抗氧化肽，研究了其中12種含2～4個氨基酸的小肽，發現這些肽具有很強的羥基自由基清除能力，但金屬螯合能力和超氧陰離子自由基清除能力卻有很大不同。Suetsuna等人[17]等以酪蛋白肽為基礎，以谷胱甘肽和肌肽作為對照物，研究了 EL、YFYPEL、 FYPEL、YPEL、PEL 等 5種肽的抗氧化活性，其中EL活性最強，而5種構成氨基酸的混合物卻不具備抗氧化活性。Saito等人[36]根據一種大豆蛋白水解物分離出來的抗氧化肽，構建了2個系列三肽文庫，其一為含His或Tyr的108個肽，其二是與PHH相關的114個肽的文庫，發現含2個Tyr的三肽比含2個His的三肽對亞油酸的過氧化抑制作用更強，YHY與酚類抗氧化劑表現了很強的協同作用，PHH的C端和N端改變并未明顯改變其抗氧化活性，在C端含有Trp和Tyr的三肽具有很強的自由基清除能力。

1.3 空間結構對抗氧化肽活性的影響

活性肽的生物活性大多與其空間結構有關。如孫穎等人[37]指出乳源性抗菌肽的二級結構與其活性密切相關。各種不同來源的抑菌肽二級結構上有許多共同的特性，N-端和C-端具有親水或兩親性β-片層或α-螺旋結構上的正電荷與細菌細胞質膜磷脂分子上的負電荷發生靜電相互作用而被吸附在細胞質膜上，可以提高抗菌活性。抗菌肽從α-螺旋轉化為β-片層能提高對G+和G-細菌的抑制效果。抗氧化肽在不同體系中發揮抗氧化作用時，空間結構是否有變化，值得深入研究。

2 抗氧化肽活性位點

某些特定氨基酸有可能成為抗氧化肽的活性位點，包括親核性的含硫氨基酸Cys和Met，芳香族氨基酸Trp，Tyr和Phe，以及含咪唑基的氨基酸His[12-13]等。芳香族氨基酸可供氫，減慢或終止自由基鏈式反應，而自身可以通過共振維持穩定。若Tyr與Asp、Glu相鄰，因Asp、Glu的羧酸根能吸電子，能減弱Tyr酚羥基上氧電子云密度，使質子更易釋放，提高了Tyr供氫能力[12]。含巰基的半胱氨酸可與自由基反應[13]，甲硫氨酸也可作為體內抗氧化劑[38]。

2.1 疏水性氨基酸

研究發現含疏水性氨基酸（如 Ala、Val、Leu）的抗氧化肽活性與這些分子中特定的疏水性氨基酸殘基與脂或脂肪酸的親和性相關[11，39]。Mendis等人[35]以魚皮為原料制得的抗氧化肽HGPLGP含有較多疏水性氨基酸。Uchida等人[40]研究發現β-伴球蛋白源抗氧化肽序列上都含有Pro殘基，脯氨酰多肽因易于氧化而發揮抗氧化活性。Rajapakse等人[41]從烏賊肉中制備出富含 Gly和Leu的抗氧化肽。Ranathunga等人[25]研究發現疏水性的Val或 Leu可以增加水-油界面肽的存在量，使其更易接近并清除脂相所產生的自由基。Bernardini等人[42]從牛肝肌漿蛋白中制備得到的9個抗氧化肽中都含有Val。Hernández等人[4]將發酵乳中水溶性部分通過RPHPLC進行分離得到抗氧化肽，研究其抗氧化活性和降壓活性，發現His、Pro（疏水性氨基酸）對抗氧化的影響最大；Trp （疏水性氨基酸）、Tyr對ABTS+自由基清除的貢獻最大，因為這類氨基酸的吲哚基和苯環可供氫。

表1 食源性蛋白質抗氧化肽的來源、評價及氨基酸序列Table 1 Sources，evaluations and amino acid sequences of food derived antioxidative peptide

Hyp的抗氧化活性對肽的活性也有影響。Kim等人[18]在研究抗氧化肽G–E–Hyp–G–P–Hyp–G–A–Hyp，G–P–Hyp–G–P–Hyp–G–P–Hyp–G和G–P–Hyp–G–P–Hyp–G–P–Hyp時發現，所有的肽都含3個Hyp，并且后兩者含3個P，作者認為Hyp和Pro的存在對抗氧化肽的活性有重要貢獻。

Murase等人[43]研究了N-長鏈酰基組氨酸和N-長鏈酰肌肽的抗氧化活性和乳化性。在含自由基引發劑甲基亞油酸酯的均相溶液中，N-長鏈酰基組氨酸和N-長鏈酰肌肽均能抑制甲基亞油酸酯氫過氧化物的生成。N-長鏈酰基組氨酸和N-長鏈酰肌肽對磷脂酰膽堿脂質體在鐵離子和抗壞血酸誘導下的氧化抑制作用比組氨酸和肌肽的作用強，原因在于其疏水性的增強。

2.2 極性氨基酸

極性氨基酸通過螯合金屬離子來發揮其抗氧化能力[44-45]。Kato等人[44]研究發現絲膠能抑制脂肪的過氧化和多酚氧化酶的活性，其可能的作用機理是絲膠中高比例的羥基氨基酸與銅和鐵的絡合。吳金鴻[45]以絲綢廢水中的絲膠為原料，水解得到IILLLAAKFG、KVIIKPLI和 QPVIAHM3個抗氧化肽，發現特征肽段氨基酸組成中都含有的 Lys和/或Pro。

2.3 酸性氨基酸

Saiga等人[22]發現豬肌原纖維蛋白的木瓜蛋白酶和蘄蛇酶E水解產物具有DPPH清除自由基作用和金屬螯合能力，其中木瓜蛋白酶水解得到酸性肽表現出比中性和堿性肽更強的抗氧化作用；酸性肽 包 括 DSGVT，IEAEGE，DAQEKLE，EELDNALN，和VPSIDDQEELM，所有的肽都含Asp或Glu，其中DAQEKLE的抗氧化活性最強；作者認為在高pH值條件下，酸性氨基酸帶電變為陰離子，這些殘基與金屬離子形成復合物，抑制了脂的氧化。Rajapakse[46]和Dávalos[47]等研究了含酸性氨基酸的抗氧化肽，發現酸性氨基酸側鏈的羧基具有螯合金屬離子的活性。

2.4 堿性氨基酸

Saiga[22]和Yong[48]都認為堿性氨基酸His的自由基清除能力源于其咪唑基的降解；肌肽的強抗氧化性是由其組氨酸的自由基清除能力和的淬滅單線態氧的能力所決定的。Suetsuna[49]采用胃蛋白酶水解對蝦肉，得到3個抗氧化肽IKK，FKK和FIKK，并測定了合成肽的抗氧化性強弱為IKK＞FKK＞FIKK。而當其構成氨基酸以等濃度混合時卻未發現任何活性。作者認為含堿性氨基酸（Lys）的肽可以作為電子接受體，接受不飽和脂肪酸氧化過程中產生的自由基的電子。Chen[50]在研究含His的肽的抗氧化活性時發現，含His的肽能夠淬滅單線態氧和羥基自由基，螯合金屬離子，而不具備對2，2'-偶氮雙（2，4-二甲基戊腈）誘導的氧化系統的抑制能力和DPPH的清除能力。Kohen[51]提出肌肽及其衍生物具有抗氧化活性主要是因His中咪唑基的存在。當咪唑環的2個氮中的1個被甲基化后，抗氧化活性減少，1-甲基咪唑幾乎無活性，表明氮環上的質子對抗氧化活性是必要的，氨基氮旁的氫無法起到供氫作用，而氮環上的氫和咪唑環旁亞甲基碳上的氫可以起到供氫作用。咪唑的氧化產物是咪唑啉酮，咪唑啉酮也具有抗氧化活性。作者還指出pH的變化影響肌肽的抗氧化活性，pH降低，H2O2清除能力也降低。

3 抗氧化肽構效關系研究方法

目前關于抗氧化肽構效關系的研究報道，主要集中于2種方法。一種是基于蛋白水解、肽的分離純化、活性測定的氨基酸組成序列分析，從而建立抗氧化肽結構與活性之間的關系。一種是不依賴水解、純化等實驗操作的基于計算機輔助分子建模的方法，通過模型的建立分析出構效關系并進行驗證。

傳統的活性鑒定下的反復分離純化，涉及大量的人力、物力和時間。定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是在一系列化合物的結構及其活性之間建立數量依賴關系的數學模型。近年來，國內外已經開展了一些關于降壓肽、苦味肽和抗氧化肽的定量構效關系的研究。通過QSAR的研究，建立活性預測模型來預測肽的抗氧化活性是目前研究者關注的一個焦點[52]。但值得注意的是，降壓肽、苦味肽的因變量指標較少，如降壓肽一般采用1gIC50、苦味肽一般采用1g（1/T），而抗氧化肽的評價指標如前所述較多，數值模擬分析較為復雜，故抗氧化肽QSAR的研究報道相對較少。

Udenigwe等人[53]通過化學計量學分析，采用偏最小二乘法回歸得到模型方程，認為含硫氨基酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸對蛋白水解物的DPPH和H2O2自由基清除能力和鐵離子還原能力具有重要作用。對于超氧陰離子自由基清除能力，只有Lys和Leu與其具有正相關性，而含硫氨基酸與之具有負相關性。帶正電荷的氨基酸、鐵離子還原能力與DPPH、H2O2清除能力呈負相關性。Li等人[54]通過QSAR模型的構建發現靠近C端的氫鍵和親水性、C端的電荷性質、N端的疏水性和電荷性質對抗氧化活性的影響較大。吳慧[55]對乳清蛋白抗氧化肽VF，LF，RVY，YSL，WYSL 和 GSTV 6 條肽段的化學結構進行了分子模擬，得到各自的穩定的優勢構象，研究了肽分子的電荷分布、前線軌道能量等，從原子凈電荷分布角度推測WYSL分子中自由基反應的活性位點為吲哚環上的N9-H49。分子對接模型和虛擬篩選也被用于降壓肽等生物活性肽的分子結構研究[56]。

4 展望

盡管在過去幾十年中，抗氧化肽的研究被普遍關注。但到目前為止，因缺乏其實際應用的相關臨床驗證資料（生物活性、有效性、致敏性和安全性）以及生產成本、口味、色澤等方面的問題[57-58]，僅有很少的商業化產品出現。而在理論上，抗氧化肽構效關系尚未闡明。不同來源的抗氧化肽是否存在相同的氨基酸序列，活性位點的分布特點及作用機理，抗氧化肽活性與構成氨基酸的關系，抗氧化肽與非肽抗氧化劑的協同增效或拮抗關系及其機理值得深入探討。將生化實驗與量子化學的數值模擬相結合，并將其應用于抗氧化肽的構效關系研究中，以期從化學和分子動力學的角度闡明活性肽的構效關系，是一條后續研究思路。

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