一株好氧除磷菌P10的篩選及除磷條件的優(yōu)化研究

仲小敏， 堵國(guó)成， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

隨著人口增長(zhǎng)，城市化高速發(fā)展，人類活動(dòng)產(chǎn)生的生活廢水、工業(yè)廢水及農(nóng)業(yè)廢水等加快了水體中碳氮磷含量的增加[1-2]，氮磷作為水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要因素之一[3-4]，其控制及減排成為水污染防治工作的重點(diǎn)。近年來(lái)污水生物除磷技術(shù)一直在不斷研究更新[5-7]，國(guó)內(nèi)外對(duì)除磷菌的篩選及性能研究也在不斷取得進(jìn)展。有部分研究者對(duì)假單胞菌和惡臭假單胞菌在好氧條件下吸磷和厭氧條件下釋磷的除磷特性進(jìn)行了初步研究[8-11]。作者對(duì)篩選的好氧除磷菌P10進(jìn)行研究，優(yōu)化其生長(zhǎng)及除磷條件，為除磷微生物制劑化的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來(lái)源 從江南大學(xué)環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室性能穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模A/O反應(yīng)器沉淀池中的剩余污泥在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線分離出的，經(jīng)藍(lán)白斑篩選法初篩并在好氧除磷能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中具有良好除磷能力的菌株P(guān)10。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨（每升）[10]:牛肉膏3 g，蛋白陳10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.02 g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

2） 葡萄糖-MOPS[7]。

3） 擴(kuò)培培養(yǎng)基（每升）[9]乙酸鈉 5 g，NH4Cl 2 g，KH2PO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.2 g，pH 7.0～7.2。

4）模擬污水（每升）[9]:乙酸鈉 925 mg，蛋白胨0.1 g， 酵母膏 0.01 g，NaCl 0.05 g，KH2PO465.5 mg，MgCl2·7H2O 153.7 mg，CaCl225 mg，pH 7.0～7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定 菌株的16S rRNA部分列克隆及測(cè)序 將克隆序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將16S rRNA的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。

1.2.2 磷的測(cè)定 鉬銻抗分光光度法 （GB 11893-1989）。

1.2.3 擴(kuò)大培養(yǎng) 200 μL菌體接種于50 mL擴(kuò)培培養(yǎng)基，在30℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20 h后接種于合成廢水測(cè)定合成廢水中培養(yǎng)前后磷含量。

1.2.4 除磷能力檢測(cè) 將6 mg菌體接種于100 mL合成廢水（接種量5%），在30℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)8 h后測(cè)定合成廢水中培養(yǎng)前后磷含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 除磷菌的篩選與鑒定

經(jīng)過10次富集、8次分離純化，藍(lán)白斑固體培養(yǎng)基初篩好氧除磷能力檢測(cè)后，從污泥中篩選到一株除磷能力強(qiáng)的細(xì)菌，編號(hào)P10。在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h，菌落為米白色、圓形、不透明、表面光滑，凸出。其電鏡照片（掃描照片，放大24 000倍）見圖1。提取基因組序列因經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆測(cè)序，將得到的16S rRNA進(jìn)行比對(duì)及同源性分析，經(jīng)鑒定，為 Pseudomonas putida。

圖1 Pseudomonas putida P10的電鏡形態(tài)特征Fig.1 Transmission electronic micrograph ofstrain Pseudomonas putida P10

2.2 Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對(duì)Pseudomonas putida P10菌體生長(zhǎng)和除磷能力的影響 選擇檸檬酸鈉、蔗糖、麥芽糖等11種常用碳源作為擴(kuò)培培養(yǎng)基，將Pseudomonas putida P10接入擴(kuò)培培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，測(cè)定其菌濃及pH，并檢測(cè)擴(kuò)培后的菌體在合成廢水中的除磷能力，見圖2。當(dāng)作為唯一碳源時(shí)菌濃最高（A600nm為3.55），其余10種則生長(zhǎng)濃度較低，甲酸鈉作為唯一碳源時(shí)擴(kuò)培效果最差。 擴(kuò)培結(jié)束時(shí)，生長(zhǎng)較好的以檸檬酸鈉碳源的發(fā)酵液呈堿性，pH值為9.31，在合成廢水中磷含量下降5.28 mg/L，平均除磷速率是 11 mg/（g·h），為最大值；其余發(fā)酵液pH值均低于7，且接入合成廢水后除磷能力較低。實(shí)驗(yàn)顯示，檸檬酸鈉有利于菌體的生長(zhǎng)和后續(xù)的除磷，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與胡子全等人[13]研究認(rèn)為不同碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和除磷效果有明顯影響的觀點(diǎn)是一致的。

2.2.2 不同初始pH對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響 將擴(kuò)培培養(yǎng)基調(diào)整為不同pH值，接入Pseudomonas putida P10培養(yǎng)20 h，測(cè)定其菌濃及pH，并檢測(cè)擴(kuò)培后的菌體在合成廢水中的除磷能力。由圖3可以看出初始pH值對(duì)擴(kuò)培有較大影響，當(dāng)初始pH值在6-8時(shí)，發(fā)酵液菌濃較高且相當(dāng)，在此區(qū)間內(nèi)初始pH值對(duì)擴(kuò)培影響不大，初始pH為6.5時(shí)發(fā)酵液菌濃最高（A600nm為3.44）；當(dāng)初始pH值小于6或大于8時(shí)，擴(kuò)培后發(fā)酵液菌濃較低。發(fā)酵液pH都有不同程度的上升。在合成廢水中檢測(cè)，當(dāng)初始pH值在6～8時(shí)，磷去除量相當(dāng)；初始pH為6時(shí)，在合成廢水中磷含量下降到5.34 mg/L（即平均除磷速率為 11.13 mg/（g·h））；當(dāng)初始 pH 值小于6或大于8時(shí)，除磷效果不佳。胡子全[13]和吳麗紅等人[14]的研究亦認(rèn)為適合的pH環(huán)境有利于菌體的生長(zhǎng)和除磷。

圖2 碳源對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on cell growth and phosphate removal

圖3 不同初始pH對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響Fig.3 Effect of initial pH on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響 將菌體接入擴(kuò)培培養(yǎng)基，在不同溫度下培養(yǎng)20 h，測(cè)定其菌濃及pH，并檢測(cè)擴(kuò)培后的菌體在合成廢水中的除磷能力，結(jié)果見圖4。溫度在30℃左右擴(kuò)培效果較好，溫度在31℃時(shí)，菌濃最高（A600nm為3.55）；這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李博等人[10]研究的結(jié)果一致。溫度低于25℃時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，發(fā)酵液菌濃較低。溫度對(duì)發(fā)酵液最終pH值影響不明顯，均在8.09左右。在合成廢水中檢測(cè)菌體細(xì)胞的除磷能力，除磷量均在5.19～5.28 mg/L之間，最高值是擴(kuò)培溫度31℃時(shí)5.28 mg/L（即平均除磷速率為 11 mg/（g·h））。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響Fig.4 Effect of different temperatures on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

2.2.4 不同金屬離子對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響 將菌體接入添加有不同金屬離子的擴(kuò)培培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后測(cè)定其菌濃及pH，并檢測(cè)擴(kuò)培后的菌體在合成廢水中的除磷能力。由圖5可以看出鐵離子、錳離子及銅離子對(duì)菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中鐵離子效果最為明顯，菌濃提高8.1% （對(duì)照A600nm為3.54）。其余金屬離子的單獨(dú)添加對(duì)菌體生長(zhǎng)未起到明顯的促進(jìn)作用，有的甚至抑制菌體生長(zhǎng)。當(dāng)加入全部微量金屬離子后，發(fā)酵液菌濃較CK提高了11.2%。培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液pH值無(wú)明顯差別，均在8.05～8.20之間。在合成廢水中檢測(cè)菌體細(xì)胞的除磷能力，含鐵離子培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體細(xì)胞和添加全部金屬離子培養(yǎng)的菌體細(xì)胞對(duì)除磷能力的影響均不明顯。此結(jié)果與李博等人[10]研究結(jié)果一致。

2.3 Pseudomonas putida P10除磷條件優(yōu)化

2.3.1 不同初始pH對(duì)除磷效率的影響 將Pseudomonas putida P10接入不同pH值合成廢水中，檢測(cè)其除磷效率。由圖6可以看出當(dāng)初始pH值小于6或大于8時(shí)，除磷效果明顯低于初始pH值在6～8；初始pH為6時(shí)，在合成廢水中磷含量下降到 5.51 mg/L（即平均除磷速率為 11.48 mg/（g·h）），除磷效果最佳；pH值在6.5～8.0時(shí)除磷效果相近。較適合除磷的pH值范圍與先進(jìn)行擴(kuò)培后再在合成廢水中進(jìn)行除磷的條件相似（圖3）。培養(yǎng)后pH和菌濃（OD600）變化趨勢(shì)相似，初始pH小于6時(shí)，培養(yǎng)后pH和菌濃均低于平均水平；初始pH大于等于6，培養(yǎng)后的pH及菌濃沒有明顯差別，均在8.1和0.6左右。

圖5 不同金屬離子對(duì)Pseudomonas putida P10生長(zhǎng)和除磷能力的影響Fig.5 Effect of different metal ions on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

圖6 不同初始pH對(duì)除磷的影響Fig.6 Effect of pH on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.2 不同溫度對(duì)除磷效率的影響 將菌體接入合成廢水，在不同溫度下培養(yǎng)20 h，測(cè)定其菌濃、pH及含磷量，由圖7可以看出，在溫度 31℃ 培養(yǎng)，除磷量最大，為5.14 mg/L（即平均除磷速率為10.07 mg/（g·h）），在溫度 28 ℃ 培養(yǎng)，除磷量為 5.07 mg/L（即平均除磷速率為 10.56 mg/（g·h））， 可見除磷的最適溫度在30℃左右，溫度過高和過低均不利于磷的去除。隨著溫度的升高，合成廢水中菌濃和pH值也隨之略有升高。菌體生長(zhǎng)和除磷狀況隨溫度變化趨勢(shì)較一致。

圖7 不同溫度對(duì)除磷的影響Fig.7 Effectoftemperature on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.3 金屬離子對(duì)除磷效率的影響 將菌體接入添加有不同金屬離子的合成廢水中，培養(yǎng)8 h后測(cè)定其菌濃、pH及含磷量。由圖8可以看出部分鐵離子和錳離子對(duì)除磷有促進(jìn)作用，其中鐵離子效果最優(yōu)，除磷量增加46.0%（CK對(duì)照組的除磷量3.63 mg/L，即平均除磷速率為 7.56 mg/（g·h））；添加錳離子除磷量增加11.1%。其余金屬離子單獨(dú)對(duì)菌體除磷未起到促進(jìn)作用，甚至起抑制作用。當(dāng)加入全部微量金屬離子后，除磷量增加68.9%。培養(yǎng)結(jié)束合成廢水pH值無(wú)明顯差別，均在8.07～8.23之間。在合成廢水中菌濃差別不大，A600nm在0.47～0.56之間。

圖8 金屬離子對(duì)除磷的影響Fig.8 Effect of metal ion on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.4 菌體對(duì)不同磷源的去除效率 合成廢水中加入不同種類的磷源以檢測(cè)菌對(duì)磷的去除效果。圖9顯示，菌對(duì)鉀鹽的去除效果比鈉鹽好，且對(duì)磷酸氫二鉀中磷的去除效果最好（除磷量5.39 mg/L，即平均除磷速率為 11.23 mg/（g·h））。

圖9 菌體對(duì)不同磷源的去除效果Fig.9 Effect of different phosphorus on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

3 結(jié)語(yǔ)

1）從江南大學(xué)環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室性能穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模A/O反應(yīng)器沉淀池中的剩余污泥中分離出一株除磷性能較強(qiáng)的菌株P(guān)seudomonas putida P10。

2）Pseudomonas putida P10的最適生長(zhǎng) pH和除磷初始pH分別為6.5和6.0；最適溫度培養(yǎng)溫度和除磷溫度為30℃；鐵離子、錳離子及銅離子對(duì)菌體生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，鐵離子、錳離子對(duì)除磷也起促進(jìn)作用，其中鐵離子作用最明顯，可以提高菌濃8.1%，提高除磷量46.0%；

3）Pseudomonas putida P10對(duì)不同的磷源去除效果相差較大，菌體對(duì)以磷酸氫二鉀狀態(tài)存在的磷去除效果最好，平均除磷速率達(dá)到為 11.23 mg/（g·h）。

[1]Levine S N，Lini A，Ostrofsky M L，et al.The eutrophication of Lake Champlain's northeastern arm:Insights from paleolimnological analyses[J].Journal of Great Lakes Research，2012，38（1）:35-48.

[2]Pauer J J，Anstead A M，Melendez W，et al.Revisiting the great lakes water quality agreement phosphorus targets and predicting the trophic status of lake michigan[J].Journal of Great Lakes Research，2011，1（37）:26-32.

[3]WANG Hai-jun，WANG Hong-zhu.Mitigation of lake eutrophication:Loosen nitrogen control and focus on phosphorus abatement[J].Progress in Natural Science，2009，10（19）:1445-1451.

[4]Otu K M，Ramlal P，Wilkinson P，et al.Paleolimnological evidence of the effects of recent cultural eutrophication during the last 200 years in lake malawi[J].East Africa Journal of Great Lakes Research，2011，1（37）:61-74.

[5]王榮斌，李軍，張寧，等.污水除磷技術(shù)研究進(jìn)展[J].環(huán)境工程，2007，25（1）:84-88.WANG Rong-bin，LI Jun，ZHANG Nin，et al.Wastewater biological dephosphorization technology research progress[J].Environmental Engineering，2007，25（1）:84-88.（in Chinese）

[6]劉燕，陳銀廣，周琪，等.強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中生化機(jī)理研究進(jìn)展[J].水處理技術(shù)，2006，32（5）:1-4.LIU Yan，CHEN Yin-guan，ZHOU Qi，et al.Progress in researches on biochemical mechanism of the enhanced biological phosphate removal process[J].Technology of Water Treatment，2006，32（5）:1-4.（in Chinese）

[7]鄒華，阮文權(quán)，陳堅(jiān).反硝化除磷工藝研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（2）:71-75.ZOU Hua，RUAN Wen-quan，CHEN Jian.Study of denitrifying dephosphatation process[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007，26（2）:71-75.（in Chinese）

[8]Morohoshi T，Yamashita T，Kato J，et al.A method for screening remove polyphosphate-accumulating mutants which remove phosphate efficiently from synthetic wastewater[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，95（6）:637-640.

[9]李博，趙敏，李寶赫.高效聚磷菌的篩選及除磷特性分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（10）:85-87.LI Bo，ZHAO Min，LI Bao-he，et al.Screening of strain LB4 with high capability of accumulating polyphosphate and its characteristics[J].Journal of Northeast Forestry University，2009，37（10），85-87.（in Chinese）

[10]蔡天明，管莉菠，崔中利，等.惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）GM6 的聚磷特性研究[J].土壤學(xué)報(bào)，2006，43（1）:117-123.CAI Tian-ming，GUAN Li-bo，CUI Zhong-li，et al.Characterization of Pseudomonas putida GM6 with high capability of accumulating poly-P[J].Acta Pedologica Sinica，2006，43（1）:117-123.（in Chinese）

[11]湯桂蘭，花日茂，孫振均，等.生物除磷的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（z1）:163-167.TANG Gui-lan，HUA Ri-mao，SUN Zhen-jun.Biological removal of phosphorus in sediments[J].Journal of Agro-environment Science，2006，25（z1）:163-167.（in Chinese）