板栗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用的研究

李清宇， 楊 穎， 賈琳斐， 彭 晶， 戴成國， 段玉峰

（陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安710062）

板栗為殼斗科栗屬落葉喬木栗樹（Castanea mollissima Blume）果實的種仁[1]。唐代孫思邈《備急千金要方》記載:“栗子，味咸溫無毒，益氣厚腸胃，補腎氣，令人耐饑，生食之，甚治腰腳不遂”。明代李時珍《本草綱目》記載:“栗治腎虛、腰腿無力，能通腎益氣，厚腸胃也，腎主大便，栗能主腎”[2]。板栗不僅含有淀粉、可溶性糖、粗纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和維生素以及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[3-5]，而且還含有糖苷類、三萜類和酚酸類等多種天然產(chǎn)物[6-11]。 研究發(fā)現(xiàn)板栗多糖可以消除體外 O2－·、·OH、NO2－·等多種自由基[12-13]，顯著升高小鼠白細胞水平和延長其凝血時間[14-15]。但板栗多糖研究僅限于分離和單糖組成分析等方面，因此，本實驗對板栗多糖進行分離純化、結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用研究，將有利于板栗活性成分及營養(yǎng)保健機理的深入研究，對板栗制品研發(fā)具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

板栗:購于陜西省鎮(zhèn)安縣，由陜西師范大學生命科學學院系統(tǒng)與進化植物學實驗室鑒定。化學試劑:均為國產(chǎn)分析純試劑；血乳酸試劑盒、血尿素氮試劑盒；南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器

U-3010 Sdetrophotometer紫外分光光度計:日本HITICHI公司產(chǎn)品；AL204型電子天平:梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；DL-4C低速大容量離心機:上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；LGJ-18C冷凍干燥機:北京四環(huán)科學儀器廠產(chǎn)品；透析袋:相對分子質(zhì)量截留8 000～14 000，美國Sigma公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 板栗多糖的提取及分離純化

2.1.1 提取流程 參照李潤豐等[16]的方法有所改動:樣品粉末→熱水提取→離心過濾→上清液→濃縮→醇析→離心過濾→沉淀→透析→離心過濾→上清液→冷凍干燥→板栗多糖。

2.1.2 分離純化 多糖分離純化工藝。參照段玉峰等[17]的方法:板栗多糖粗品→DEAE-52纖維素柱層析→洗脫→收集洗脫液→濃縮→真空冷凍干燥→板栗多糖各級分半純品→SephadexG-100柱層析→洗脫→收集洗脫液→濃縮→真空冷凍干燥→板栗多糖純品。

2.1.3 多糖純度鑒定 利用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法[18]進行分離純化及純度鑒定。在板栗多糖中加入蒸餾水充分溶解，上柱，用蒸餾水洗脫，洗脫速度0.05 mL/min，每管收集6 mL。隔管利用苯酚-硫酸[19]法檢測490 nm處吸收峰，以洗脫管數(shù)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制洗脫曲線，收集對稱峰各管。

2.1.4 多糖相對分子質(zhì)量測定 測定板栗多糖相對分子質(zhì)量選用液相滲透色譜法[19]，選用藍色葡聚糖和標準葡聚糖作為標準品做標品相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間的標準曲線，利用標準曲線求出板栗多糖的相對分子質(zhì)量。

2.2 多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析

氣相色譜分析稱取干燥樣品10 mg，加入2 mL的1 mol/L的H2SO4，抽真空封管，100℃水解12 h，水解液用BaCO3中和過濾后，真空干燥，然后加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶混勻，90℃水浴反應30 min后取出冷卻至室溫，再加入1 mL醋酸酐90℃水浴乙酰化反應30 min，反應物減壓蒸干，用2 mL三氯甲烷充分溶解，按此法分別制備各種標準單糖進行氣象色譜分析，結(jié)構(gòu)分析采用紅外光譜法[15]。

2.3 多糖抗疲勞實驗的研究

2.3.1 動物分組及給藥 小鼠隨機分為對照組、多糖低劑量組 （100 mg/（kg·d））、 以及中劑量組（200 mg/（kg·d））和高劑量組（300 mg/（kg·d）），自由攝食和飲水，連續(xù)灌喂21 d。

2.3.2 負重游泳實驗及力竭游泳時間的測定[20]連續(xù)灌胃給藥21 d后開始進行力竭性游泳實驗。測定當天正常喂食、喂水，小鼠的負重量約為體質(zhì)量3.0～4.0 g，測定力竭時間時人工驅(qū)趕小鼠不停游泳至完全沒入水中8～10 s不出水面即可定為力竭，記錄游泳時間。比較4組的力竭時間，說明補充板栗多糖對小鼠抗疲勞作用的影響。

2.3.3 相關指標測定 小鼠連續(xù)灌喂21 d，末次灌喂30 min后，將小鼠置于游泳箱中不負重游泳90 min，水溫（30±1）℃。游泳前及游泳后25 min眼球取血，測定小鼠血乳酸（BLA）和游泳后90 min后取眼球血，測定小鼠血尿素氮（BUN）的含量，小鼠經(jīng)脫頸椎處死后立即取后肌肉和肝臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干，按照試劑盒的說明，進行肌糖原和肝糖原含量的測定。

3 組成與結(jié)構(gòu)

3.1 板栗多糖粗品的纖維素DEAE-52柱層析

依次使用 0.1，0.2 mol/L的 NaCl進行梯度洗脫，繪制洗脫曲線見圖1。

圖1 0.1，0.2 mol/L的NaCl進行梯度洗脫曲線Fig.1 Elution curve by 0.1，0.2 mol/L NaCl on DEAE-52 Colum

由圖1可知，板栗多糖粗品在DEAE-52纖維素柱上用0.1 mol/L NaCl洗脫可達到有效分離，收集13～25管洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥為白色絮狀物，得到0.809 6 g板栗多糖CPS-1。板栗多糖粗品在DEAE-52纖維素柱上用0.2 mol/L NaCl洗脫可達到有效分離，收集37～55管洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥為白色絮狀物，得到1.071 4 g板栗多糖CPS-2。

3.2 板栗多糖的純度鑒定

3.2.1 板栗多糖葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析為了得到單一的多糖組分，采用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法對經(jīng)纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-1、CPS-2進一步分離純化和純度鑒定，選用蒸餾水作為洗脫劑，CPS-1、CPS-2在SephadexG-100層析柱上的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 CPS-a、CPS-b在SephadexG-100層析柱上的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of CPS-a，CPS-b on SephadexG-100 column

由圖2可知，纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-1在SephdexG-100柱層析時得到單一對稱的洗脫峰，收集對稱峰位置，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得板栗多糖純品CPS-a。經(jīng)纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-2在SephdexG-100柱層析時得到單一對稱的洗脫峰，收集對稱峰位置，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得板栗多糖純品CPS-b。

3.2.2 板栗多糖的相對分子質(zhì)量測定 根據(jù)實驗方法中的色譜條件，取標準品進樣并記錄洗脫峰保留時間。繪制標準曲線時縱坐標為標準品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值，橫坐標為相應峰的保留時間，進過線性回歸，得標準曲線線性回歸方程為:lgMw=-0.554 5RT＋8.969 9，式中Mw為平均相對分子質(zhì)量，RT為保留時間（單位:min），相關系數(shù)R2=0.999 3。根據(jù)線性回歸方程計算得CPS-a和CPS-b的平均相對分子質(zhì)量分別為34 500和52 100。

3.3 板栗多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析

氣相色譜分析結(jié)果:混合標準品單糖的氣象色譜圖如圖3所示，CPS-a和CPS-b中的單糖氣相色譜圖如圖4和5所示。

圖3 混合標準品單糖的氣相色譜圖Fig.3 GC of the mixed standard monosacharides

混合標準品單糖的氣相色譜圖中單糖與主要色譜峰的對應關系:阿拉伯糖為4.187，鼠李糖為4.205，核糖為 4.55、4.718，木糖為 5.182，甘露糖為6.282，果糖為6.403，半乳糖為6.812，山梨糖為6.855，葡糖糖為7.115。

由圖4可知，CPS-a主要由葡萄糖∶甘露糖∶木糖∶阿拉伯糖=7.123∶6.281∶5.036∶4.19。 由圖 5 可知，CPS-b主要由葡萄糖∶果糖∶甘露糖∶木糖∶阿拉伯糖=7.123∶6.423∶6.289∶5.053∶4.19。

圖4 CPS-a水解物氣相色譜圖Fig.4 GC of Hydrolysates of CPS-a

圖5 CPS-b水解物氣相色譜圖Fig.5 GC of Hydrolysates of CPS-b

3.4 板栗多糖的紅外光譜分析結(jié)果

CPS-a和CPS-b的紅外光譜分析結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖6 CPS-a紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of CPS-a

圖7 CPS-b紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrogram of CPS-b

由圖可知，CPS-a 和 CPS-b 在 3 400、2 900、1 640、1 400、1 075～1 000 cm-1附近區(qū)域都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖的特征吸收峰。3 600～3 200 cm-1出現(xiàn)的寬峰是分子內(nèi)和分子間的O-H的伸縮振動，吸收峰寬是由于分子內(nèi)羥基之間形成氫鍵；2 900 cm-1附近吸收峰是由于C-H伸縮振動引起；1 640 cm-1附近吸收峰是C=O伸縮振動和NH變角振動；C-H變角振動引起1 400 cm-1附近吸收峰；1 075～1 000 cm-1附近的吸收峰說明CPS-a、CPS-b都含有吡喃環(huán)；1 250～980 cm-1間較大的吸收峰是由C-O的伸縮振動引起，其中一種是C-OH，另一種為C-O-C。CPS-a在931 cm-1附近吸收峰是呋喃糖衍生物A型吸收，853 cm-1附近吸收峰是呋喃糖衍生物C型吸收。CPS-b在1 354 cm-1、1 273 cm-1附近的吸收峰都是S=O伸縮振動引起，分別是磺酰基和硫酸基，表明此糖鏈可能是硫酸化多糖，915、857、764 cm-1附近的吸收峰表明糖鏈中同時存在 α-、β-糖苷鍵。

4 抗疲勞實驗結(jié)果分析

4.1 小鼠負重游泳力實驗結(jié)果

由表1可以看出，各劑量組的游泳時間均高于對照組，除低劑量組以外，中劑量組和高劑量組與對照組比均達到統(tǒng)計學上的顯著水平 （p＜0.05，p＜0.01），分別比對照組游泳時間增加了27%和44%，說明板栗多糖可以提高小鼠的耐力，具有抗疲勞的效果。

表1 板栗多糖對小鼠游泳時間的影響Table 1 Effect on the swimming time

4.2 小鼠血乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）實驗結(jié)果

由表2可知，游泳前各劑量組與對照組的血乳酸含量無明顯差異，游泳25 min后3個給藥劑量組的血乳酸含量明顯低于對照組（p＜0.05，p＜0.01），中劑量組和高劑量組中血乳酸的濃度與對照組相比降低更加明顯。靜息期各劑量組與對照組的血尿素氮含量無太大差別，游泳90min后，對照組小鼠血尿素氮含量增加了43%，顯著高于各計量組 （p＜0.05，p＜0.01）。

表2 板栗多糖對血乳酸和血尿素氮濃度的影響Table 2 Effect on BLA and BUN content in swimming

由表3可知，低劑量組在游泳前后，肌糖原和肝糖原都無顯著的變化，中劑量組和高劑量組對小鼠游泳前后的肌糖原和肝糖原影響都很顯著 （p＜0.05，p＜0.01）。

表3 板栗多糖對肌糖原和肝糖原質(zhì)量分數(shù)的影響Table 3 Effect on glycogen in mice

5 結(jié)語

1）實驗分離得到的板栗多糖CPS-a與楊利劍等[15]的實驗結(jié)果相吻合，即板栗多糖的單糖組分為阿拉伯糖，甘露糖，木糖和葡萄糖。何玲玲等[12]研究表明是在紅外譜圖4 000～400 cm-1區(qū)間出現(xiàn)的吸收峰為多糖類物質(zhì)的一般特征吸收峰。而本實驗分離得到的板栗多糖CPS-a與何玲玲等實驗所得CPS1為同一物質(zhì)。

2）糖原是運動中最重要的能源物質(zhì)，機體劇烈運動后大量產(chǎn)生糖原被消耗，因此糖原儲備可作為評價機體抗疲勞的重要指標。通過實驗可以看出，板栗多糖對小鼠力肝糖原和肌糖原均有著顯著而積極的影響，從而延緩疲勞的出現(xiàn)。

通過測試小鼠的劇烈運動后血乳酸和血尿素氮的含量可以看出，運動后，低、中、高計量給藥組明顯低于對照組說明板栗多糖可以加速過多乳酸的清除代謝，減少乳酸的產(chǎn)生并加速運動后乳酸的清除，從而延緩疲勞的發(fā)生。

研究表明機體血尿素含量變化可說明體內(nèi)含氮物質(zhì)分解狀態(tài)，也是評價機體在特殊條件下體力勞動負荷承受能力的一個較靈敏的指標。機體血尿素氮含量隨勞動及運動負荷的增加而增加，機體對負荷的適應能力越差，血尿素氮的增加就越明顯。本實驗結(jié)果顯示，游泳后低、中、高劑量組血尿素氮的含量明顯低于對照組，提示板栗多糖能夠是小鼠的運動負荷能力提高，不易發(fā)生疲勞。

總體實驗結(jié)果表明板栗多糖能夠延緩疲勞的產(chǎn)生和加速疲勞的消除，并且中劑量組200 kg/（mg·d）的效果最明顯，高劑量組并無明顯效果。

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