三聚氰胺免疫親和柱的制備和測試

徐麗廣， 劉麗強， 匡 華， 彭池方， 宋珊珊， 歐陽華， 胥傳來

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

2008年的“三鹿”奶粉事件導致30多萬嬰兒住院，是我國近年來出現的最嚴重的食品安全事件，嚴重損害了我國食品制造的國際聲譽，給我國乳制品產業造成了前所未有的重大損失[1-3]。不法分子利用傳統凱氏定氮檢測方法的漏洞，在生乳中添加工業原料三聚氰胺來獲得較高的“表觀蛋白質”水平，導致劣質有害奶粉的大量生產[4]。三聚氰胺已被證實可引起嬰兒腎結石，各個國家和政府組織均制訂了乳制品中該物質的最大殘留限量。我國規定，乳制品中三聚氰胺的質量分數不得高于2.5 mg/kg，嬰幼兒乳品中的最大質量分數不得高于1 mg/kg。相應地，我國出臺了三聚氰胺的標準檢測方法（GB/T 22388）。目前報道的檢測方法也多基于色譜和質譜的檢測方法。這些方法需要復雜的前處理，從提取到凈化耗費大量的有機溶劑和固相萃取小柱[5-9]。

快速高效的樣品前處理技術可以大大簡化和加快檢測流程。免疫親和層析柱，是基于抗體或抗原大分子的綠色前處理手段，可以集提取和凈化于一身，無需大量有毒有害溶劑，而且可以多次重復使用，因而越來越受到分析人員的青睞[10-13]。作者以三聚氰胺單克隆抗體做為識別體，裝填了具有高柱容量的親和層析小柱。目前對于三聚氰胺分離富集免疫層析小柱的報道尚未看到，將為食品中三聚氰胺的檢測提供了新的前處理手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三聚氰胺抗體，作者所在實驗室自制，半數抑制率（IC50）為6 ng/g，與三聚氰胺親和常數為2.67×109L/mol，與除了與滅蠅胺的交叉反應為132%外，與其他三聚氰胺類似物無交叉反應。四甲氧基硅烷（TMOS）和 PEG400:購自 Sigma（上海）貿易有限公司；三聚氰胺及其他試劑:購自中國醫藥集團上海化學試劑總公司。

1.2 儀器與設備

電子天平AB104-N型:購自上海Metller Toledo Group；精密酸度計PHS-3TC型:購自上海天達儀器有限公司；紫外掃描儀U-3000型:購自日本島津公司；可見分光光度計722型:購自上海分析儀器廠；高效液相色譜－質譜聯用儀（LC/MS）LCQDECA型:美國非尼根公司產品；WH-2微型旋渦混合儀和HPD-25D真空泵:購自上海滬西分析儀器廠；可調試移液器:購自美國熱電公司。

1.3 溶液配制

磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）配制參考文獻方法[14]。淋洗液為含質量分數0.05%Tween-20的0.02 mol/L PBS溶液；上樣溶液為含體積分數10%甲醇的0.02 mol/LPBS溶液；洗脫溶液為含有體積分數50%甲醇的0.01 mol/L pH 3.5甘氨酸-鹽酸溶液（稱取甘氨酸7.5 g，加入12 mol/L HCl 10 mL，甲醇500 mL，純水定容至1 000 mL）。再生液為含質量分數0.05%Tween-20的0.01 mol/L的PBS溶液。

三聚氰胺標準溶液配制:稱量0.1 g的三聚氰胺藥品，用磷酸鹽緩沖液溶解定容至1 000 mL，即為100 μg/mL的標準溶液。用上樣緩沖液將100 g/mL的標準溶液分別稀釋配成質量濃度為50、25、10、5、2.5、1 μg/mL，500、250、100、50、25、10、5、2.5、1、0 ng/mL。每個質量濃度配成100 mL，置于4℃保存備用。

1.4 IAC柱制備

量取抗體溶液，用 PBS（0.01 mol/L pH 7.4）緩沖液稀釋至1 mg/mL，4℃保存備用。取0.2 mL HCl（0.04 mol/L），0.75 mL 去離子水，0.2 mL PEG400 和3.4 mL TMOS混勻，在4℃放置2～3 min預冷卻。然后將其放入冰水中，超聲混勻30 min，量取該溶液，按照體積比1∶2的比例將其加入預冷的抗體溶液中，期間緩慢攪拌，待凝膠形成后，稱取容器質量，將凝膠置于37℃恒溫烘箱凝膠老化。待凝膠失去初重的50%時，老化過程結束。將老化后的凝膠（約1 g）研磨碎，能過30～40目篩即可，然后進行裝柱。每個柱中裝填體積為1 mL；待柱中凝膠沉積穩定后，用5 mL PBS預淋洗，洗去未包埋的抗體IgG和其他干擾雜質，最后用5 mL PBS平衡。制備好的IAC柱中保留1 mL的PBS溶液，加上塞子和蓋子，在4℃環境中保存備用，長期保存需加質量分數0.02%疊氮化鈉作為防腐劑。

1.5 IAC柱的評價

1.5.1 柱容量測試 取制備好的親和層析小柱，回復至室溫后，取下柱子上下端的塞子，將柱子與真空泵連接，調節流速，使柱子里面的液體以2 d/s的速度流出（流量不大于1 mL/min）。待液體排干后，將10 mL 10 μg/mL處理后的三聚氰胺溶液（溶解于上樣緩沖液中）上樣，流量同上。收集流出液，測定A240nm值。待液體排干后，分別用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL純水淋洗小柱，流速同上。分別收集淋洗液，并測定A240nm值。然后，加洗脫液2 mL到小柱中，調節流量1 d/s（不超過0.5 mL/min），收集洗脫液，測定A240nm值。分別用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS清洗再生小柱，收集所有濾液，測定A240nm值。 漓干后，將柱子下端用塞子密封，然后加入3 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS平衡保存液，上端用塞子密封，置于4℃保存。

1.5.2 三聚氰胺紫外吸收標準曲線建立 采用紫外光譜儀，測定配制的三聚氰胺標準溶液，在240 nm下的光密度值（OD），以標準品的濃度為橫坐標，不同標準品的A240nm值為縱坐標，建立三聚氰胺微克級（μg/mL）標準曲線。采用液相色譜質譜，以三聚氰胺的質量濃度為橫坐標，以三聚氰胺峰面積為縱坐標，建立納克級（ng/mL）標準曲線。根據建立的標準曲線，分別計算柱容量測試中收集的濾液中三聚氰胺的質量濃度。

1.5.3 三聚氰胺小柱回收率測試 分別上樣1、10、100、1 μg/mL質量濃度的三聚氰胺溶液10 mL。按照上述方法操作小柱，收集洗脫液，分別采用紫外光譜儀和液相色譜質譜進行測定洗脫溶液，根據相應的紫外吸收標準曲線和 計算洗脫液中三聚氰胺的含量，計算回收率（公式如下所示）。

其中V1為上樣體積 （mL）；C1為上樣質量濃度（ng/mL）；V2為洗脫液體積 （mL）；C2為洗脫液質量濃度（ng/mL）

1.5.4 三聚氰胺小柱富集系數測試 上樣10 ng/mL濃度水平的三聚氰胺溶液100 mL；用0.5 mL的洗脫液洗脫4次，分別進行洗脫液接收，然后測定每管洗脫液的A240nm，根據紫外吸收標準曲線計算三聚氰胺的含量。計算當回收率大于70%時，所需要的洗脫液總體積。

其中:V1:上樣體積（mL）；V2:洗脫液體積（mL）

1.5.5 三聚氰胺小柱再生次數測試 選取3支小柱，采用500 ng/mL質量濃度的三聚氰胺溶液3 mL上樣測試，收集洗脫液，測定洗脫液的A240nm，根據紫外吸收標準曲線計算三聚氰胺的含量。測定小柱的平均回收率。每天測試一次，連續測試12 d。

2 結果與分析

2.1 三聚氰胺標準曲線

2.1.1 微克級標準曲線確定 用紫外掃描儀測得微克級標準溶液（1，2.5，5，10，25，50，100 μg/mL）的A240nm值，建立標準曲線，如圖1所示。y＝0.0145 x+0.023 2，線性度（R2）為 0.997 9，其中 x 為三聚氰胺的質量濃度，y為溶液的A240nm值。

圖1 三聚氰胺微克級標準曲線Fig.1 Standard curve of melamine

2.1.2 納克級標準曲線的確定 利用液相質譜測得 ng級三聚氰胺標準溶液的濃度（10，25，50，100，250，500 ng/mL）的質譜圖，方法參考國家標準GB/T 22388，譜突如圖2所示.

圖2 納克級標準溶液液相色譜一質譜圖Fig.2 LC-MS spectrum for melamine detection

以標準品的質量濃度為橫坐標，不同質量濃度標準品的面積為縱坐標，繪制出三聚氰胺的標準曲線如圖3所示:標準曲線方程為y=0.115 4x+4.131 6，線性度（R2）為 0.984 2；其中 x 為質量濃度，y 為質譜峰相對峰面積。

圖3 三聚氰胺納克級標準曲線Fig.3 Standard curve of melamine

2.2 免疫親和柱的柱容量

柱容量測試中，上樣溶液濾液收集體積10 mL，淋洗液收集體積10 mL，收集洗脫液2 mL，洗滌液和再生溶液體積20 mL，根據濾液的吸光度值，采用標準曲線方程，計算各個濾液中三聚氰胺的質量濃度，將各含量用下面公式計算出柱容量:柱容量=洗脫液體積×洗脫液；計算得到柱容量為16.47 μg。

2.3 回收率

將1，10 ng/mL，100 ng/mL的上樣質量濃度的三聚氰胺洗脫液進行色譜－質譜測試，根據峰面積采用ng級標準曲線y=0.115 4x+4.131 6，測定得出三聚氰胺質量濃度，根據回收率公式計算出回收率。將1 μg/mL質量水平的洗脫液，測定出A240nm值，根據三聚氰胺紫外吸收標準曲線計算三聚氰胺濃度，根據回收率公式計算出回收率如表1所示。

表1 不同質量濃度三聚氰胺樣品的回收率Table 1 Recovery of melamine in different concentrations

2.4 富集系數

分別測定了4份洗脫液在240 nm下的紫外吸收值，結果如下表2所示，根據標準曲線y＝0.014 5x+0.023 2計算出三聚氰胺的質量濃度水平，并計算出回收率。從表2可知，當使用1.5 mL洗脫液時，回收率即可達到70.34%，當使用2.0 mL洗脫液時，回收率達到80%以上，根據富集系數計算公式，得出富集系數為66。在免疫親和柱的使用過程中，研究發現適當控制濾液流速，可以保證包埋抗體對目標物質的捕獲，流量控制在1 mL/min以下較好。

2.5 再生次數

表2 洗脫液中三聚氰胺質量濃度測定和回收率結果Table 2 Results of melamine level and recovery in eluent solutions

測定結果見表3。在本試驗中，小柱的測試是每天使用一次，當小柱累計使用次數為5時，IAC小柱的回收率為63%，當累計使用次數為4時，回收率均高于70%。使用次數為8時，回收率均高于40%，之后再重復使用，小柱的回收率則大幅下降，10次使用后則下降至12%左右。由于抗體屬于生物大分子，容易受到離子濃度、溶液pH及有機溶劑的破壞，通過再生緩沖液的使用，延長了小柱的使用壽命。

表3 IAC小柱重復使用次數測定Table 3 Detection for possible reusage of IAC columns

3 結語

采用硅烷化包埋的方法制備了三聚氰胺的免疫親和層析柱，并對三聚氰胺免疫親和小柱的使用性能進行了測定，小柱的柱容量為16.47 μg/柱，富集系數為66，小柱連續使用12次后，發現，使用5次后小柱的平均回收率仍然在60%以上，使用4次后平均回收率在70%以上。試驗中采用淋洗液減少了潛在的非特異性吸附效應。免疫親和小柱在樣本處理時具有高度特異性，且可重復使用以及其在使用過程中不涉及到大量有毒有害溶劑的使用，有望成為樣本前處理手段的發展方向。

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