雙歧桿菌發酵工藝研究進展

柳俊靈

（青島科技大學,山東 青島 266042）

雙歧桿菌(Bifidobacterium)首次發現是由Henry Tissier于1899年從母乳喂養的嬰兒糞便中分離得到[1]。雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性桿菌,對氧十分敏感，對低pH耐性差，極易失活，最適pH為6.5～7.0，最適生長溫度37～42℃[2]。雙歧桿菌能有效地維持腸道正常菌群平衡，同時對于抗腹瀉、抗便秘、抗感染、抗腫瘤等方面也有獨特的生理功能。雙歧桿菌在生長過程中產生的維生素、氨基酸類營養物質能改善牛奶的營養價值，因此在牛奶生產中廣泛應用[3]。但由于雙歧桿菌對生長環境要求嚴格，致使在生產中菌株培養較困難，生產周期長，產品活菌數量少等問題。為解決這類問題，國內外學者對雙歧桿菌培養條件和發酵工藝進行了廣泛的研究報道。

1 培養基中各成分對雙歧桿菌發酵的影響

1.1 碳源

通常用葡萄糖等單糖和低聚糖作為雙歧桿菌生長的主要碳源。邵建寧等[4]通過改變碳源、pH和添加低聚糖研究其對長雙歧桿菌生長的影響，得到最佳培養基，在此培養基中37℃培養20h后，菌落數達8.9×109cfu/mL，較基礎培養基培養時間縮短4h，活菌數提高8.1倍。鹿曉菲等[5]研究出適合工業生產的低成本培養基，以廢糖蜜、玉米漿代替培養基中的碳源、氮源，同時添加番茄汁、低聚果糖，經培養32h后，活菌數可達4.33×109cfu/mL，有較高的工業應用價值。

1.2 氮源

氮源主要是胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物等。種克等[6]對雙歧桿菌麥芽復合汁增菌培養基進行研究，結果表明大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿可顯著促進兩岐雙歧桿菌增殖。酵母膏富含核苷酸、蛋白質，對活菌數有明顯的影響，生產中缺少酵母膏菌體將停止生長。肖仔君等[7]報道了酵母膏對短雙歧桿菌有較為顯著的影響，在以TPY為基礎培養基的優化培養基中培養18h后，菌數可達2.1×1010cfu/mL。王振國[8]對苦豆籽粕—雙歧桿菌合生元進行了研究，結果表明在培養基中添加6%質量分數的苦豆籽粕對兩歧雙歧桿菌的體外生長有明顯的促進作用，兩歧雙歧桿菌活菌數的數量級是對照組的1000倍。

1.3 生長因子對雙歧桿菌的促生長作用

生長因子對雙歧桿菌的增殖有顯著作用。增殖因子主要包括低聚糖類雙歧因子、蛋白質水解形成的肽類、天然植物及中草藥提取物類等。

1.3.1 低聚糖類

低聚糖類是雙歧因子的主要組成部分，目前常見的低聚糖主要有低聚木糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖等20余種。項明潔[9]等研究了低聚果糖對雙歧桿菌增殖效果及腸道菌群的影響，研究結果表明在厭氧液體培養基加入低聚果糖后雙歧桿菌菌數由1.5×108cfu/mL增加到3×108cfu/mL。

1.3.2 蛋白質水解肽類產物

蛋白質水解肽類雙歧因子主要有乳清蛋白、乳鐵蛋白、酪蛋白水解物、胃粘膜蛋白水解物等。工業中常用的蛋白類雙歧因子中增殖效果最為明顯的是酵母浸提液，除此之外大豆胰蛋白酶水解物和牛肉浸膏在工業中應用也較為廣泛。吳敏等[10]對影響嬰兒雙歧桿菌生長的雙歧因子進行了研究，結果顯示雙歧因子對其活化的影響程度依次為酵母浸提液、酪蛋白胨、磷酸氫二鉀。C.Janer[11]研究發現在牛乳培養基中添加2%酪蛋白時，雙歧桿菌活菌數比對照組提高1.51g，而在添加2%的乳清蛋白的牛乳培養基中，雙歧桿菌菌落數達到最高。研究發現這些物質對雙歧桿菌的生長促進活性與它們的二硫鍵有密切關系。

1.3.3 天然植物及中草藥浸提物

天然植物材料中，如番茄汁、胡蘿卜汁、平菇汁、黃芪等均含有雙歧桿菌需要的生長因子，一些中藥浸提物如枸杞中也含有較為豐富的雙歧因子。韓雪等[12]通過正交試驗研究了4種天然提取物平菇汁、卷心菜汁、豆漿、胡蘿卜汁對雙歧桿菌增殖的效果，按最佳配比添加后雙歧桿菌活菌數達2.58×109cfu/mL，較添加前增加2.95倍，。劉彥亮[13]研究了以黃芪浸提液為主要原料的黃芪復合增菌培養基，在優化培養基中培養雙歧桿菌16h后，活菌數可達 4.59×109cfu/mL。Szilard Kun 等[14]研究表明胡蘿卜汁對雙歧桿菌的增菌效果顯著，雙歧桿菌在單一的胡蘿卜汁中培養時菌落數可達108cfu/mL。

1.3.4 短鏈脂肪酸類和其它類

短鏈脂肪酸、乳酸菌素、稀土元素及無機鹽離子等也是對雙歧桿菌有增殖作用的雙歧因子。張樹和等[15]研究發現大豆多糖對雙歧桿菌增菌效果明顯與低聚果糖一致，具有益生元特性。郭思建等[16]發現乳酸菌素對雙歧桿菌有很強的促生長作用，且雙歧桿菌增菌效果與乳酸菌素濃度高低有密切關系，高濃度乳酸菌素液促進雙歧桿菌生長效果較好。

2 發酵條件對雙歧桿菌生長的影響

2.1 pH值

pH值影響反應液中物質的電荷狀態，雙歧桿菌細胞內酶氨基酸電離狀態和細胞內酶的活性。舒國偉等[17]研究了pH值及接種量對兩株兩歧雙歧桿菌BB01、BB03生長的影響。結果表明，BB01、BB03的最適生長pH分別為6.5和6.0。提高菌株的耐酸性具有工業應用價值，熊三玉等[18]通過反復馴化將兩歧雙歧桿菌馴化成耐氧耐酸耐膽鹽的優良菌株，經過耐酸馴化的菌株在低pH值條件下的產酸性明顯優于未經馴化的菌株。林娟等[19]采用馴化和紫外線誘變兩種方法選育雙歧桿菌耐酸耐氧菌株，與原始菌株相比，誘變株在pH4.5液體培養基中生長速度加快，衰亡速度減緩，在36h達最大活菌量，72h仍保持較高活菌量。

2.2 溫度和接種量

溫度和接種量在雙歧桿菌發酵過程中是兩個重要的因素。溫度對菌體的生長和發酵的影響是各種因素綜合表現的結果。適宜的溫度對菌體的增殖和產物的產量的提高有較大的影響。鮑行豪等[20]研究了培養液預溫對雙歧桿菌生長的影響，結果表明預溫后37℃培養20h即可達到菌體最高生物量，較預溫前提前12h。接種量對雙歧桿菌的生長也有一定影響，接種量增加，在相同時間內對活菌總數有一定影響，研究表明雙歧桿菌培養最佳接種量為4%～5%。

2.3 氧

雙歧桿菌對氧及其敏感，有氧條件下雙歧桿菌會形成H2O2、O2-、HO·等活性氧，這些活性氧基團在細胞內積累會對細胞形成毒害作用。目前較多文獻研究了氧對雙歧桿菌生長的影響。據報道，氧氣會影響雙歧桿菌的糖代謝[21]。而雙歧桿菌葡萄糖代謝酶的基因在環境脅迫下也發生表達量的變化[22，23]。趙建云等[24]采用半定量RT-PCR法對在4%氧氣條件下培養的長雙歧桿菌BBMN68的葡萄糖代謝中關鍵酶基因m RNA表達水平進行了比較。研究發現，隨著氧氣濃度增加，長雙歧桿菌BBMN68的生長逐漸受到抑制，在氧質量分數為4%脅迫條件下，葡萄糖磷酸變位酶等多種酶在氧脅迫30min時的m RNA表達明顯下降。基于雙歧桿菌對氧要求嚴格的這一特性，使得其工業生產存在較多困難，如對生產設備要求較高、工藝過程較為繁瑣等。

因此對菌株進行耐氧馴化或用基因技術獲得耐氧菌株是解決這一問題的有效方法。如張莉滟[25]利用電場誘導原生質體融合的方法，融合了兼性厭氧菌保加利亞乳桿菌與長雙歧桿菌，篩選得到的融合子具有一定的耐氧性。李青青[26]利用考察篩選了9株雙歧桿菌的耐氧性，通過增加氧氣濃度的方式進行復篩，得到的耐氧雙歧桿菌能抵抗液體培養時氧氣的攝入并能獲得較高的生長量。鑒定得出該耐氧雙歧桿菌為Bifidobacterium.animalis.subsp.lactis.

3 培養技術對雙歧桿菌發酵的影響

常用的生產雙歧桿菌的方法是分批培養，這種培養方法可造成底物耗盡和阻遏物的積累，使生物量和產物在培養后期不再增加呈穩定狀態。為了解決分批培養出現的問題，現在研究的趨勢是高密度培養方法（High cell-density culture）。常用的高密度培養方法有分批補料培養、過濾培養和連續培養等，下面就分批補料培養和連續培養做詳細論述。

3.1 補料分批培養

補料分批技術解決了分批培養中底物的限制及產物的抑制。白文[27]研究了青春雙歧桿菌補料高密度培養的方法，以青春雙歧桿菌液體分批培養研究為基礎，補加堿液調整發酵過程中培養基的pH，同時補加葡萄糖以消除碳源減少對雙歧桿菌增殖的抑制，使發酵罐高密度培養對數期延長8h，最大活菌數由 3.9×108cfu/mL 提高到 4.6×109cfu/mL，實現了青春雙歧桿菌的高密度培養。倪雪朋等[28]研究了不同培養技術對耐氧兩歧雙歧桿菌生長的影響，結果表明流加培養效果最好，小瓶培養、發酵罐間歇培養次之。流加培養可延長雙歧桿菌生長周期，使雙歧桿菌的OD值達到1.167，活菌數達2.87×1010cfu/mL，明顯高于優化培養基。

3.2 連續培養

曹郁生等[29]研究了雙歧桿菌厭氧連續培養的技術，連續培養方法較靜置批量培養得到的活菌數高活力好，單位容積的產量高。通過控制連續培養系統pH值為6.0，采用不同稀釋率檢查其對培養物的影響，達到穩定時分析其活菌數量、乳酸和乙酸產量。結果表明當稀釋率為0.064h-1時，培養液中的活菌數達5.2×108cfu/mL。

4 發展與展望

21世紀功能性食品是食品發展的主流，滿足不同人群需要的特殊營養品已成為我國食品工業的發展重點，而雙歧桿菌的功能性恰好適合這一趨勢。目前對于雙歧桿菌在微生態制劑、功能性食品和藥品等方面的研究越來越多。因此優化雙歧桿菌發酵工藝，實現大規模工業化生產意義重大。

目前對于雙歧桿菌的研究在優良菌株選育、耐氧馴化、冷凍干燥、微囊化等方面取得了一定的成果，解決了菌株高密度高活性培養的困難，以及對生產設備要求嚴格、不耐受胃酸等問題，為該菌的實際工業應用提供了保障和可能。但鑒于雙歧桿菌本身固有的生理特點，目前我們還沒有完全掌握雙歧桿菌的特性，產品常溫下保存的穩定性也有待提高。除此之外我們還需要通過控制發酵過程逐漸完善高密度發酵；通過完善發酵設備更好地監測菌株生長狀態；結合發酵工藝，簡化操作工藝、降低成本實現雙歧桿菌生產的規?；a業化。

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