MicroRNAs與糖代謝的研究進展*

劉 佳 張 宏

MicroRNAs（miRNAs） 是一組長約 19～25個核苷酸（nucleotides，nt）的小分子非編碼RNA，廣泛存在于動植物中，在進化過程中高度保守，在階段性發育、器官發育、細胞分化、信號傳導、代謝和腫瘤的發生過程中都發揮了至關重要的作用，近年來發現miRNAs也參與葡萄糖的代謝調節。本文將miRNAs對糖尿病的調節作用綜述如下。

1 MiRNA的產生和作用機制

MiRNAs絕大部分位于基因間隔區，本身不具有開放閱讀框架。多數動物miRNAs位于前體mRNA的內含子中，這種安排利于mRNA和內含子中的miRNAs共同轉錄。這些miRNA加工成熟機制基本相同，首先在細胞核內編碼miRNAs的基因通過RNA聚合酶轉錄成初級miRNAs（primiRNAs），之后在一種 RNaseⅢ（Drosha）酶和它的伴侶分子DGCR8組成的復合物作用下，剪切為約70 nt、具有莖環結構的 miRNAs前體（pre-miRNAs）。MiRNAs前體在 Ran-GTP 依賴的Exportin-5的作用下，從核內運輸到胞漿，在Dicer酶的作用下被剪切成21～25 bp。最后在RNA解旋酶作用下生成成熟的miRNA，成熟miRNAs結合到RNA誘導的基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中發揮作用。

當被miRNAs激活時，miRISC作為miRNAs途徑的效應復合物特異性識別靶基因mRNA 3′非翻譯區（untranslated regions，UTR）上相應靶位點，并通過堿基互補配對的方式與之結合，介導mRNA衰減或抑制翻譯的進程[1-2]。在植物中大多數miRNAs通過和靶mRNA完全互補結合導致mRNA的降解，而在動物中通過不完全互補結合抑制翻譯下調基因表達。動物不完全互補結合位點通常在 “種子序列”，它是3′UTR中同miRNAs 5′末端2～8 nt匹配、有較強保守性的一段序列，后來也被很多預測靶基因的軟件和算法作為miRNAs作用靶基因應當滿足的條件。

2 MiRNAs與糖尿病

MiRNAs可直接調節胰腺細胞的發育、胰島素的釋放及其在外周組織的作用。

2.1 MiRNAs與胰腺細胞發育 MiR-375可在斑馬魚胰島的發育中起作用，敲除miR-375可導致胰島形態發育缺陷。Lynn等[3]研究發現小鼠孕14.5 d胰腺發育過程中有107種miRNAs發生改變，其中miR-375在胰腺內分泌前體細胞表達，并且和胰十二指腸同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）共同作用。敲除miR-375的純合子小鼠表現為胰腺β細胞總量減少，提示miR-375在胰腺β細胞發育中起了重要的作用；在小鼠胰腺發育早期刪除Dicer1的RNaseⅢ結構域（同時使用Pdx-1增強子）可使所有胰腺細胞，特別是分泌胰島素的β細胞明顯減少；而在胰腺發育晚期刪除Dicer（使用胰島素增強子），無論在胰腺的形態學還是β細胞數量都沒有改變，提示miRNAs可能是整個胰腺發育中所必需的，并且主要作用于發育的早期。Poy等[4]進一步證實，敲除miR-375的小鼠胰島α細胞數量增加，空腹和餐后胰高糖素水平增加，糖異生和肝糖輸出增加，同時β細胞數量減少，提示miR-375對維持胰腺α、β細胞數量和生理功能都具有重要作用。

MiR-124a也在胰島β細胞中大量存在，在發育的胰腺中低表達，在孕期和生育年齡顯著增高，提示miR-124a可能在調節胰腺β細胞發育中起作用[5]。叉頭蛋白A2（forkhead box protein A2，FoxA2）是已經確立的miR-124a的靶基因，可調節β細胞特異轉錄因子Pdx-1、內向整流鉀通道6.2（inwardly-rectifying potassium channel 6.2，Kir6.2） 和磺脲類藥物受體1（sulfonylurea receptor 1，Sur1）的表達。在小鼠胰島素瘤細胞系MIN6細胞過表達或沉默miR-124a可導致FoxA2水平和其下游基因Pdx-1、Kir6.2和Sur-1的改變，提示其在胰腺β細胞發育過程中也發揮了重要作用。同時，在胰腺內分泌細胞分化中至關重要的轉錄因子神經元素3可被miR-15a/b、miR-16和miR-195調節，也提示其在胰腺發育中的重要作用。

2.2 MiRNAs與β細胞胰島素的釋放 在正常的胰島β細胞，胰島素的分泌依賴葡萄糖濃度和細胞內鈣離子信號的改變。Poy等[6]從胰腺β細胞系MIN6和α細胞系TC1克隆出胰島特異性miR-375，推斷其可調節胰島素釋放。MiR-375過度表達可抑制葡萄糖誘導的胰島素分泌。肌侵蛋白（myotrophin，Mtpn）是miR-375預測的靶基因，細胞實驗顯示，以siRNA沉默Mtpn基因可模擬miR-375過表達所引起的葡萄糖刺激下胰島素釋放的減少和胞吐作用的抑制，同時miR-375可直接和Mtpn 3′UTR結合，證實Mtpn是miR-375的直接靶基因。此發現第一次確定了一個哺乳動物miRNAs基因的生物功能。后來研究顯示，miR-375對Mtpn蛋白的表達和胰島素釋放的調節作用可能是通過轉錄核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 起作用，NF-κB 的激活和葡萄糖刺激的胰島素釋放增加有關。

El Ouaamari等[7]應用數據庫分析顯示，在3′-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1 （3′-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1）3′UTR 有 miR-375結合位點，在 β 細胞系中過表達miR-375可使PDK1蛋白表達減少，下游蛋白激酶B通路、糖原合成酶激酶 3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）磷酸化水平下調、β細胞數量減少及壽命縮短。自發性2型糖尿病Gyoto-Kakizaki（GK）大鼠胰島中miR-375表達減少，在離體大鼠胰島中，高糖可降低miR-375的表達。生物信息學分析顯示，Pdx-1和神經元分化因子1基因存在于miR-375基因附近的保守位點內，提示miR-375可能在調控胰腺發育和功能維持的調控網絡中發揮作用。

除了miR-375，通過PicTar靶基因預測數據庫預測得到許多其他的 miRNAs，包括miR-124a和 let-7b，可和Mtpn的3′末端結合。MiR-375、miR-124a和let-7b在MIN6細胞系中大量存在[5]，let-7b在小鼠大多數組織普遍存在，而miR-375和miR-124a有組織特異性和細胞特異性表達。三者可協調一致，共同調節靶基因的表達，當三種miRNAs共同作用時，Mtpn水平顯著低于其分別作用的結果。在MIN6細胞過表達的miR-124a在基礎血糖水平可促進胰島素的釋放，而高糖條件下抑制胰島素的釋放。MiR-124a可與Rab27A上的保守位點結合，提示其是miR-124a直接的靶基因。MiR-124a對胰島素釋放的調節可能還有SNAP25、Rab3A、Synapsin-1A、Rab27A和Noc2的參與。

Plaisance等[8]研究發現，在胰島細胞過表達miR-9可嚴重抑制葡萄糖或鉀離子誘導的細胞外分泌，其作用可能是通過下調轉錄因子Onecut2的表達，增加與β細胞分泌顆粒有關的Rab GTPase增強子Granuphilin/Slp4的活性來發揮負性調控胰島素分泌作用的。而下調Granuphilin可使胰島素分泌增高，提示在胰島細胞中適度的miR-9表達對維持Granuphilin表達水平和胰島素分泌能力有重要的調節作用。Esguerra等[9]發現與Wistar大鼠相比，GK大鼠胰島細胞有24種miRNAs表達升高，6種降低，其中miR-335可與突觸融合蛋白結合蛋白1的3′UTR結合，提示miR-335亦可能參與胰島素釋放。

2.3 MiRNAs與胰島素在外周組織的作用 胰島素信號在外周組織傳導障礙，認為是胰島素抵抗形成的關鍵。Herrera等[10]發現與對照組相比GK大鼠肝臟和脂肪組織中分別有12種和5種miRNAs改變。Kl觟ting等[11]對腹部手術患者大網膜脂肪研究顯示，miR-17-5p和miR-132在糖尿病患者中顯著下降，并且和胰島素敏感性指數有關。

2.3.1 脂肪組織 Esau等[12]研究顯示miR-143在脂肪細胞的分化中上調，以反義寡核苷酸抑制miR-143的活性，可使胰島素敏感葡萄糖轉運子4、激素敏感脂肪酶、脂肪酸結合蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體α的表達下調，增加三酰甘油聚集，抑制脂肪細胞分化。敲除miR-143可引起脂肪細胞中ERK5蛋白表達明顯升高，提示miR-143可能通過靶基因ERK5參與脂肪細胞分化。腹型肥胖胰島素抵抗小鼠腸系膜脂肪組織miR-143顯著升高，且miR-143表達水平與體質量和腸系膜脂肪含量顯著正相關。脂肪細胞的分化過程中miR-17-92也顯著上調，可通過抑制腫瘤抑制因子Rb2/p130的表達加速脂肪細胞的分化。

He等[13]在GK大鼠骨骼肌的研究發現，2種miR-29家族成員miR-29a和miR-29b在糖尿病組升高，進一步研究顯示，miR-29家族在所有的3個胰島素靶器官——肌肉、脂肪和肝臟都上調。在小鼠的脂肪細胞3T3-L1中過表達miR-29a/b/c可抑制胰島素刺激下葡萄糖的攝取。高水平的miR-29可在高糖高胰島素培養的細胞中模擬胰島素抵抗狀態。以高糖高胰島素干預3T3-L1脂肪細胞可引起miR-29a/b升高，miR-29c不變。熒光素酶報告基因系統證實胰島素誘導基因 1（insulin induced gene 1，Insig1）和 Caveolin 2（Cav2）是miR-29a/b/c的靶基因。過表達miR-29可導致Insig1和Cav2水平的下降，顯著抑制胰島素刺激的葡萄糖攝取，促發胰島素抵抗，導致糖尿病的發生。

2.3.2 肝臟 非酒精性脂肪肝以肝臟脂肪聚積為特征，是胰島素抵抗重要的肝臟表現。與無代謝綜合征的患者相比，非酒精性脂肪肝患者血miR-122可下調63%。將針對miR-122的反義寡核苷酸注入小鼠體內可導致血漿膽固醇和三酰甘油水平降低，進一步將小鼠的肝細胞取出培養，發現肝臟脂肪酸和膽固醇合成減少，脂肪酸氧化增加，表明miR-122可調節小鼠的脂代謝[14]。同時，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性也增加。在HepG2細胞中過表達miR-122可導致包括類固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBP）-1c/2、脂肪合成酶和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶等幾乎所有脂肪形成的關鍵基因表達顯著下降。

Li等[15]亦以miRNA芯片的方法研究顯示，與正常對照組相比，ob/ob 小鼠肝臟中 8 種 miR（miR-34a、-31、-103、-107、-194、-335-5p、-221 和-200a）上調，3 種 miR（miR-29c、-451和-21）下調，提示這些miRNAs可能參與了肝臟中葡萄糖的代謝。進一步研究顯示在肥胖小鼠肝臟或脂肪中過表達miR-103/107均可導致胰島素敏感性下降，miR-103/107的失活可增加其靶基因Caveolin 1的表達，伴有胰島素受體穩定性的增加和脂肪體積的下降[16]。Godlewski等[17-18]研究發現膠質母細胞瘤中miR-451降低，其可通過靶向結合腫瘤抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶復合物的伴侶鈣結合蛋白39，抑制包括AMPK在內的下游一系列蛋白激酶的活性。MiR-451的水平可隨血糖水平變化而變化，能量充裕時miR-451表達升高，可通過抑制AMPK信號途徑增加細胞增殖的速率。葡萄糖缺乏時，miR-451水平下調，激活AMPK，抑制細胞增殖速率，增加細胞存活和遷移。MiR-21通過激活PTEN依賴的P13K信號通路調節吉西他濱誘導的膽管癌細胞的凋亡；P13K是胰島素信號通路中的重要分子，推測miR-21可能通過作用于胰島素信號通路中的某些分子，參與對胰島素的釋放和調節作用。

胰島素受體底物 1（insulin receptor substate 1，IRS-1）是胰島素信號傳導通路中重要的成分。IRS-1基因敲除小鼠表現為體型小和胰島素抵抗。Ryu等[19]通過熒光素酶報告基因系統證實IRS-1是miR-126的直接靶基因，在轉染miR-126前體質粒的SK-Hep1肝細胞中，miR-126過表達可使IRS-1表達降低75%并減少IRS-1磷酸化水平，但不影響其下游基因Akt2和GSK3b的表達。在胰島素刺激下，在減少IRS-1表達的同時，也可降低Akt2和GSK3b的表達，并且其降低是通過IRS-1直接作用的。

2.3.3 骨骼肌 Huang等[20]發現GK大鼠和對照組相比，骨骼肌miR-24顯著下調。熒光素酶報告基因系統證實miR-24可與代謝調節中的重要因子p38-MAPK 3′UTR特異位點結合，提示p38-MAPK是miR-24的直接靶基因，并且此結合位點在人、大鼠和小鼠中高度保守。

Granjon等[21]在志愿者中行高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗前及3 h后骨骼肌活檢比較，有37種miRNAs下調，對應基因編碼的蛋白主要參與胰島素信號傳導和泛素介導的蛋白水解，其中miR-1和miR-133a有明顯的改變，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中得到同樣的結果；而正胰島素高葡萄糖鉗夾實驗對志愿者骨骼肌的miR-1和miR-133a無明顯影響，提示胰島素水平而非葡萄糖濃度對miR-1和miR-133a發揮作用。胰島素可通過激活SREBP-1c下調肌細胞增強因子 （myocyte enhancer factor，MEF）-2C， 影響 miR-1 和miR-133a的表達；過表達SREBP-1c可下調miR-1和miR-133a的表達，而敲除SREBP-1c基因可增加胰島素刺激下miR-1和miR-133a的表達。以MEF-2C特異抗體與primiR-1-2和pri-miR-133a-1之間的增強子結合位點結合，可顯著減少miR-1和miR-133a的表達，證實胰島素下調miR-1和miR-133a的表達是通過激活SREBP-1c下調MEF-2C實現的。

3 結論與展望

與轉錄因子相比，miRNAs的調控機制可能更能夠滿足生物體精密而協調的基因表達調控需要。更重要的是miRNAs的作用本身就是生物體內天然存在的調控方式，因此如果能找到對胰島素抵抗和糖尿病調控的miRNAs，模擬天然miRNAs，人工構建靶向miRNAs的前體或合成miRNAs反義寡核苷酸，必將對胰島素抵抗和糖尿病等代謝相關性疾病的治療提供一個新的藥物靶點。

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