沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌共增菌培養(yǎng)基的研制

王永志，余以剛，黃秀麗，肖性龍,*，吳 暉

(1.華南理工大學(xué)食品安全與檢測(cè)中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省惠州市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 惠州 516003)

由食源性微生物導(dǎo)致的疾病一直是食品安全的最大隱患之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年死于飲食被污染的食物或水而引發(fā)的腸胃疾病的人數(shù)高達(dá)220萬(wàn)[1]。全球各國(guó)也都投入了大量的人力物力監(jiān)管和控制食源性微生物的傳播和危害。其中，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌都是重點(diǎn)的監(jiān)控對(duì)象。作為腸道致病菌，沙門(mén)氏菌和志賀氏菌存在廣泛、危害巨大。沙門(mén)氏菌在世界范圍內(nèi)都是最主要的食物和水的污染源之一[2]，而志賀氏菌主要是困擾著發(fā)展中國(guó)家，據(jù)統(tǒng)計(jì)亞洲每年1000人中平均有2.1個(gè)感染者[3]。值得注意的是，這兩種細(xì)菌的兒童發(fā)病率都顯著高于成人[3-4]。金黃色葡萄球菌不僅能給污染食品，還對(duì)臨床病人的健康造成很大危害。與志賀氏菌類(lèi)似，金黃色葡萄球菌污染情況在貧困國(guó)家更為嚴(yán)重[5]。在中國(guó)，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌也對(duì)居民健康帶來(lái)巨大隱患。一份關(guān)于中國(guó)1994—2005年發(fā)生的食源性疾病的報(bào)告顯示，超過(guò)30%的相關(guān)案例都與這3種細(xì)菌有關(guān)，沙門(mén)氏菌更是高居首位[6]。為了降低這3種食源性疾病對(duì)民眾健康帶來(lái)的隱患和政府財(cái)政帶來(lái)的負(fù)擔(dān)，一套快速有效的監(jiān)控系統(tǒng)應(yīng)該盡快被建立。

研究人員已經(jīng)提出了多種方法來(lái)檢測(cè)和監(jiān)控食源性微生物。依賴(lài)于基因的檢測(cè)方法——PCR以及衍生方法由于其快速、高效獲得了廣泛的應(yīng)用[7]。多重?zé)晒釶CR的應(yīng)用更是大大提高了同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌的效率。一般說(shuō)來(lái)，多重?zé)晒釶CR檢測(cè)需要一個(gè)前增菌的過(guò)程，在此過(guò)程中如何有效體現(xiàn)特異選擇性，成為當(dāng)前共增菌培養(yǎng)基研究的熱點(diǎn)之一。至今已有許多關(guān)于選擇性共增菌培養(yǎng)基的研究。俞彩娥[8]研究了沙門(mén)氏菌和志賀氏菌共增技術(shù)。

Kim等[9]提出并評(píng)估了一種能夠同時(shí)增菌培養(yǎng)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157和單增李斯特菌的培養(yǎng)基。本課題組也曾研制了一種能夠同時(shí)培養(yǎng)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的共增菌培養(yǎng)基[10]以及一種可用于水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌前增菌的培養(yǎng)基[11]。

本實(shí)驗(yàn)提出一種能夠同時(shí)培養(yǎng)沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)基。在設(shè)計(jì)好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加各種促進(jìn)劑和抑制劑等各種添加劑，通過(guò)測(cè)定這3種細(xì)菌在添加了各種物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況并加以進(jìn)行篩選。確定最終配方之后，再對(duì)這個(gè)新的共增菌培養(yǎng)基進(jìn)行初步的評(píng)估和驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)(CMCC 47731)、鮑氏志賀氏菌(Shigellosis boydii)(CMCC 51346)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CMCC 41002) 本實(shí)驗(yàn)室保藏；小腸耶爾森氏菌(CMCC 52225)、大腸桿菌O157:H7(ADCPC 931)、綠膿桿菌(CMCC 10211)、副溶血性弧菌(CMCC 20015)、變形桿菌(CMCC 40150)、單增李斯特菌(CMCC 34761)、蠟樣芽孢桿菌(CMCC 70331)等來(lái)自東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯、Baird-Parker氏培養(yǎng)基、HE瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、卵增液、多黏菌素B等廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甘氨酸、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、水楊酸、甘露醇、煌綠水、牛膽鹽、疊氮化鈉、萘啶酮酸、亞碲酸鉀等 上海阿拉丁生物科技有限公司；其余試劑皆為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

752S紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；THZ-92C氣浴振動(dòng)培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)3種細(xì)菌的不同特性以及生長(zhǎng)的不同條件，考慮簡(jiǎn)便性和經(jīng)濟(jì)性，選擇沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分?；A(chǔ)培養(yǎng)基的配方和制作方法為：稱(chēng)取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2.5g、葡萄糖2.5g、氯化鈉35g加入到1000mL蒸餾水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，滅菌后存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 共增菌培養(yǎng)基中添加成分的篩選

參考之前的研究[10-11]和3種目標(biāo)菌各自選擇培養(yǎng)基中的特異成分，選擇可能的抑制劑和促進(jìn)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。甘氨酸、檸檬酸鐵銨、氯化鋰、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、水楊酸、甘露醇、煌綠水、牛膽鹽、疊氮化鈉、萘啶酮酸、乳糖等被列為添加成分，以一定的質(zhì)量濃度加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種后37℃、180r/min培養(yǎng)24h，在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度(OD)值。確定該共增菌培養(yǎng)基的配方和制作方法。

1.2.3 目標(biāo)菌在此培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)評(píng)估

已確定的培養(yǎng)基中分別接入一定量的目標(biāo)菌，使其初始菌濃為103CFU/mL，37℃培養(yǎng)18h。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長(zhǎng)處的OD值。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 非目標(biāo)菌在此培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)

觀察大腸桿菌O157、單增李斯特菌、小腸耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、綠膿桿菌、變形桿菌和蠟樣芽孢桿菌等在此培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。在制備的培養(yǎng)基中分別接入菌濃為103CFU/mL的沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌3種目標(biāo)菌及雜菌，37℃培養(yǎng)18h。用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長(zhǎng)處的OD值。以營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 共增菌各成分的確定

2.1.1 抑制劑的選擇

由表1可知，甘氨酸對(duì)志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制強(qiáng)于對(duì)沙門(mén)氏菌，18g/L質(zhì)量濃度條件下3種細(xì)菌幾乎完全不能生長(zhǎng)。選擇加入氯化鋰較低劑量時(shí)，3種細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況在可接受的范圍之內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定質(zhì)量濃度的檸檬酸鈉對(duì)沙門(mén)氏菌具有促進(jìn)作用，對(duì)志賀氏菌生長(zhǎng)影響較低，卻顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。硫代硫酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌和志賀氏菌抑制強(qiáng)烈，較低的劑量就會(huì)完全抑制這兩種菌生長(zhǎng)。煌綠水對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另外兩種菌。疊氮化鈉對(duì)3種細(xì)菌的抑制作用都非常強(qiáng)烈，而多黏菌素B和萘啶酮酸一樣，只對(duì)沙門(mén)氏菌和志賀氏菌有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的作用較為溫和。在較低劑量之下，牛膽鹽對(duì)3種菌的抑制作用均不強(qiáng)烈。亞碲酸鉀對(duì)沙門(mén)氏菌和志賀氏菌的抑制作用較低。由于金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生凝固酶且其染色體上存在cysM，亞碲酸鉀的抑制作用便不能發(fā)揮[12]。事實(shí)上，含有亞碲酸鉀的瓊脂培養(yǎng)基往往被用來(lái)分離金黃色葡萄球菌。實(shí)驗(yàn)也表明，在含有0.3mg/L亞碲酸鉀的培養(yǎng)基中，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況良好。

表1 各促進(jìn)劑和抑制劑對(duì)3種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of candidate agent on the growth speed of three bacteria

2.1.2 促進(jìn)劑的選擇

丙酮酸鈉可為微生物生提供必需的碳源，對(duì)3種細(xì)菌的作用都比較溫和。卵增液能夠顯著地促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，對(duì)志賀氏菌有強(qiáng)烈的抑制作用。水楊酸對(duì)3種菌都有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。與沙門(mén)氏菌和志賀氏菌不同的是，金黃色葡萄球菌能夠分解乳糖，故其在含有乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況更好。實(shí)驗(yàn)表明，低劑量的甘露醇對(duì)3種細(xì)菌都具有促進(jìn)作用，在一定質(zhì)量濃度條件下對(duì)鮑氏志賀氏菌的促進(jìn)作用尤為明顯。

綜合考慮以上添加物質(zhì)對(duì)沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況的作用，以能夠使3種菌同時(shí)快速的生長(zhǎng)以及對(duì)其他雜菌有抑制作用為標(biāo)準(zhǔn)，選擇牛膽鹽、氯化鋰作為抑制劑，選擇甘露醇作為促進(jìn)劑。

2.1.3 共增菌選擇培養(yǎng)基的制備

稱(chēng)取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2.5g、葡萄糖2.5g、氯化鈉35g、氯化鋰0.5g、牛膽鹽0.1g、甘露醇2g添加到990mL蒸餾水中，加熱溶解。冷卻至室溫后矯正pH值為7.2。稱(chēng)取0.3mg亞碲酸鉀溶解入10mL已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液。在無(wú)菌條件下，亞碲酸鉀溶液加入原溶液中。所得培養(yǎng)基分裝貯存于4～6℃。命名該培養(yǎng)基為SSS肉湯。

2.2 目標(biāo)菌在復(fù)合培養(yǎng)基(SSS)中增菌效果的驗(yàn)證

沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌在SSS肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)中的生長(zhǎng)情況分別如圖1～3。沙門(mén)氏菌在SSS中生長(zhǎng)時(shí)，12h就能達(dá)到近109CFU/mL的濃度，與在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)情況類(lèi)似，說(shuō)明在SSS肉湯中沙門(mén)氏菌擴(kuò)增效率高。由于氯化鋰帶來(lái)的一定的抑制作用，志賀氏菌在SSS肉湯中的生長(zhǎng)速率要慢于在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的速率，可以看出，在SSS肉湯中生長(zhǎng)12h后，志賀氏菌菌濃接近105CFU/mL，生長(zhǎng)20h時(shí)可達(dá)108CFU/mL。與營(yíng)養(yǎng)肉湯相比，金黃色葡萄球菌在SSS肉湯的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)出滯后性，大約需要6h才能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。12h后金黃色葡萄球菌的菌液濃度可達(dá)到106CFU/mL，18h可達(dá)109CFU/mL。綜上所述，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在SSS肉湯中均能快速生長(zhǎng)，18h能分別達(dá)到菌液濃度107CFU/mL，能夠滿足后續(xù)檢測(cè)的需要。

圖1 沙門(mén)氏菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth curve of Salmonella in SSS and nutrient broths

圖2 志賀氏菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth curve of Shigellosis in SSS and nutrient broths

圖3 金黃色葡萄球菌在共增菌培養(yǎng)基肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth curve of Staphylococcus aureus in SSS and nutrient broths

2.3 非目標(biāo)菌在SSS肉湯中的生長(zhǎng)情況

表2 目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌在SSS肉湯中的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth speed of target and non-target bacteria in SSS broth

以營(yíng)養(yǎng)肉湯作對(duì)照，其他的食源性致病菌在SSS肉湯中的生長(zhǎng)情況也被測(cè)定。由表2可知，目標(biāo)菌株沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在該復(fù)合增菌肉湯中均能快速生長(zhǎng)，18h培養(yǎng)情況下的生長(zhǎng)情況能夠滿足檢測(cè)的要求。非目標(biāo)菌株大腸桿菌O157、蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌、變形桿菌、副溶血性弧菌和綠膿桿菌的生長(zhǎng)則受到抑制。其中蠟樣芽孢桿菌、小腸耶爾森氏菌和綠膿桿菌完全不能生長(zhǎng)，大腸桿菌O157、副溶血性弧菌和綠膿桿菌生長(zhǎng)受到抑制，18h生長(zhǎng)后菌液濃度低，不會(huì)對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)等造成干擾。

3 討 論

當(dāng)前的食品安全問(wèn)題愈演愈烈，引起社會(huì)和媒體的極大關(guān)注，也給相關(guān)監(jiān)管部門(mén)帶來(lái)了巨大的壓力。單平臺(tái)、高通量、高效率是給食源性致病菌檢測(cè)提出的新挑戰(zhàn)，也推動(dòng)了一系列相關(guān)新技術(shù)的發(fā)展，如多重PCR[13]、多重?zé)晒釶CR技術(shù)[14]、DNA微陣列雜交技術(shù)[15]、免疫微陣列技術(shù)[16]等。

本實(shí)驗(yàn)討論了一種能夠同時(shí)富集沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的共增菌培養(yǎng)基。應(yīng)用SSS肉湯可以對(duì)可能含有多個(gè)菌株污染的樣品進(jìn)行增菌檢測(cè)。該培養(yǎng)基除含有微生物生長(zhǎng)必需的碳源、氮源等外，還有牛膽鹽、氯化鋰、亞碲酸鉀等，可以有效對(duì)除沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌之外的非目標(biāo)菌進(jìn)行抑制[17]。研究顯示，氯化鋰對(duì)單增李斯特菌具有較強(qiáng)烈的抑制作用[18]，而牛膽鹽可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。亞碲酸鉀對(duì)霍亂弧菌、腸桿菌的生長(zhǎng)有著廣泛的抑菌作用[11,19]，較高濃度的氯化鈉也可以帶來(lái)一定的抑菌作用[20]，從而有效保證了SSS肉湯的選擇性。

本實(shí)驗(yàn)表明在應(yīng)用SSS肉湯的情況下，初始濃度為103CFU/mL的3種細(xì)菌在培養(yǎng)18h之后濃度可達(dá)107CFU/mL，可以滿足PCR檢測(cè)限的要求。非目標(biāo)菌株在此培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)為完全不生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)活性低。常規(guī)的PCR檢測(cè)前增菌包括兩個(gè)過(guò)程，一是所有可能污染微生物的增菌過(guò)程，然后再有相應(yīng)的選擇性增菌過(guò)程。SSS肉湯的應(yīng)用可以合并兩個(gè)過(guò)程為一，增菌后能夠直接應(yīng)用于后續(xù)的檢測(cè)中，提高了檢測(cè)效率。

今后的研究可以深入探討各種抑制劑的抑菌機(jī)理和3種目標(biāo)菌同時(shí)存在的生長(zhǎng)情況，并研究SSS肉湯對(duì)壓力損傷細(xì)菌和酸損傷細(xì)菌的恢復(fù)能力。通過(guò)人工污染的方法進(jìn)行實(shí)際樣品的檢驗(yàn)，探討如何消除培養(yǎng)基的存在對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

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