非熱加工對食物過敏原影響的研究進展

謝秀玲，李 欣，高金燕，陳紅兵*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院食品系，江西 南昌 330047)

食物過敏是人們對食物的一種不良反應，也屬醫學領域的變態反應。它的臨床癥狀表現主要有蕁麻疹、皰疹樣皮炎、口腔過敏綜合癥、結腸綜合癥、哮喘等，嚴重時可導致過敏性休克，危及生命[1]。在歐美等發達國家，食物過敏反應危害著約3%～4%的成年人和6%的兒童，而且發病率還在逐年增加[2]。我國尚缺乏大規模的流行病學調查數據，但小范圍的調查以及大量的病例報道預示我國也處在一個增長的階段。毋庸置疑，食物過敏嚴重影響了部分人群的生活質量，是一個值得高度關注的食品營養衛生與食品安全問題，通過食品加工控制食物過敏原并為食物過敏患者提供安全的食品是食品工業的重要任務之一。因此，本文主要介紹各種非熱加工對食物過敏原的控制研究，通過各種非熱加工的處理，探究食物過敏原的致敏性的變化，期望在不改變食物營養價值的條件下，獲得脫敏性食物，滿足食物易敏人群的正常飲食需求。

1 食物過敏的致敏成分

食物中多種成分都有可能導致食物過敏，但目前一致認為食物中的蛋白質是最主要的致敏成分，因此也備受關注，人們常稱之為食物過敏原。過敏原蛋白是食物過敏反應的主要誘因，而過敏原表位是過敏反應的物質基礎。過敏原表位包括線性表位和構象性表位，線性表位一般由5～7個氨基酸組成，是與抗體結合的連續氨基酸序列，而構象性表位則是由15～22個氨基酸構成，這些氨基酸分布于同一條肽鏈的不同部位或不同肽鏈上[3]。有研究[4]報道表明，在天然狀態下，過敏原蛋白有90%以上的表位是構象性表位。過敏原蛋白空間結構不穩定，易隨外界環境的變化而發生空間分布的改變。由于食品加工可以影響食物過敏原結構及其致敏性表位，尤其構象性表位易受影響。因此，通過各種加工技術可能控制食物過敏原的致敏性，從而為構建食物過敏原脫敏制備技術提供理論可行性。

2 非熱加工控制食物過敏原

食物的加工技術主要包括熱加工和非熱加工，采用傳統的熱加工手段，過敏原蛋白質易變性而改變過敏原結構，影響其致敏性，但卻會導致產品的深加工受到限制，而且熱加工參數的范圍也有限，從而無法在有限的加工條件下，針對不同過敏食物，尋求到更多的既降低致敏性又保留其再加工性能的方法。而非熱加工技術手段實現了在低溫條件下處理食物過敏原，既能保存食物的營養物質、新鮮感和風味，又能更大范圍地改變過敏原的結構，從而影響其致敏性。非熱加工控制食物過敏原的方法包括物理、化學、酶法以及生物學方法。

2.1 物理方法

2.1.1 超高壓

過敏原蛋白質的空間三維結構是由多肽鏈相互折疊而成，超高壓會影響氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價鍵[5]，破壞蛋白質三級、四級結構，但對共價鍵沒有影響[6]。有研究[7]報道，小于150MPa的壓力能促進蛋白質低聚體的結構解離；大于150MPa的壓力會使蛋白質解鏈和解離后的低聚體亞單位重新聚合；尤其在200MPa以上的壓力條件下蛋白質的三級結構會發生劇烈變化。

食物過敏原經超高壓處理后，過敏原蛋白的致敏性、水解能力、疏水性等各種功能結構特性改變。Chicón等[8]在pH6.8條件下分別采用200MPa和400MPa壓力處理牛乳中過敏原β-乳球蛋白，β-乳球蛋白與兔抗IgG的結合能力增加，推測可能由于高壓導致蛋白空間結構發生變化，影響其致敏性。而Kleber等[9]則采用不同的壓力(200、400、600MPa)對β-乳球蛋白分別處理10、30min后，發現分子內弱的非共價鍵發生斷裂并重新聚合，致敏性隨著壓力和時間的增加而增加。Pe as等[10]研究發現，經100MPa壓力處理后，大豆乳清蛋白水解能力沒有變化，而用200MPa和300MPa的壓力處理后，水解能力明顯增加，且經300MPa壓力處理后，水解產物幾乎沒有致敏性。Zeece等[11]用800MPa的壓力對β-乳球蛋白處理后，得出β-乳球蛋白在不到1min的時間內幾乎全部被消化完全，并降解成小于1500D的小分子物質，高級結構基本破壞。董曉穎等[12]在對蝦過敏原致敏性的研究中發現，經100～500MPa的壓力處理后其致敏性呈現先降低后增加的趨勢，在壓力為400MPa時處于最低點。他們分析這可能是由于在壓力變化過程中蛋白質結構發生可逆變化，過敏原表位開始時被掩蓋，后來隨壓力的增加過敏原表位逐漸暴露。謝丹丹等[13]則用150MPa壓力處理南美白對蝦35min后，其水溶性蛋白的致敏性降低。此外，作者所在課題組在前期研究中發現，雞蛋過敏原卵白蛋白經高壓處理后，其致敏性先降低后升高，推測當壓力在40～90MPa時，卵白蛋白分子結構展開，疏水性基團暴露，其致敏性隨壓力的升高而降低；在120～180MPa時，卵白蛋白分子一方面在β-折疊結構交聯的作用下形成聚合體，另一方面由于壓力過大，已形成的一些凝聚體又被打破形成可溶性聚合體，導致卵白蛋白的致敏性升高[14]。另外，還得出經超高壓處理后花生過敏原蛋白Ara h 2、Ara h 6與抗體的結合能力隨著壓力的升高而降低，抗原性明顯降低，而且粗蛋白溶液中的其他成分不影響Ara h 6蛋白在超高壓處理過程中的抗原性變化，也顯示了超高壓處理控制食物過敏原致敏性的功能[15-16]。

2.1.2 輻照

輻照能夠使部分蛋白質分子發生解聚、交聯、裂解，致使蛋白分子的空間結構、構象改變，從而改變食物致敏性[17]。比如，Kume等[18]用0～7kGy的輻照劑量處理雞蛋過敏原卵白蛋白，蛋白質三級結構受到影響，其表面疏水性隨著輻照劑量的增加逐漸增加；且經4kGy劑量處理后有明顯的聚合現象，聚合后其致敏性進一步降低。Byun等[19]則研究發現輻射處理后，對蝦的熱穩定蛋白與IgE的結合能力降低。在2002年，Byun等[20]分別又用0～10kGy的輻照劑量處理牛乳過敏原β-乳球蛋白，結果表明高劑量的輻照破壞了β-乳球蛋白的表位結構，使其不能準確地識別IgE的結合位點，當輻照劑量大于7kGy，與IgE的結合能力小于50%。顧可飛等[21]對蝦過敏原Pen a 1進行輻照處理后，其結構出現可逆變化，0～7kGy劑量輻照處理時，該蛋白發生空間結構改變，雙螺旋解聚，雙鏈打開，疏水性基團外露，而當輻照劑量在7kGy和10kGy時，疏水性有所減弱，他們認為蛋白質肽鏈發生聚合、交聯、解聚、斷裂等一系列變化，出現一些聚合物和降解肽段，這些產物的致敏性明顯降低。這一發現也證實并解釋了Byun等[19]之前的研究結果。而劉光明等[22]發現粗提取的蟹類過敏原原肌球蛋白經3～7kGy的輻照處理后過敏原性無明顯變化，10kGy輻照處理后其過敏原性降低。另外，本課題組的研究表明，輻照處理對花生過敏蛋白Ara h 2和Ara h 6的二級結構影響很大，且當處理劑量為5kGy時，其二級結構即有明顯變化。Ara h 2經輻照處理后，抗原性明顯降低，且隨著輻照劑量增加，抗原性逐漸降低，10kGy處理可使Ara h 6的抗原性降低95%，即10kGy輻射處理可基本消除Ara h 6的抗原性[15-16]。該研究結果再次顯示了輻照處理在制備脫敏蛋白中的強大功能，但是，由于強輻照會產生劑量殘留，因此，輻照對過敏原蛋白結構的影響仍有許多未解決的問題。

2.1.3 超聲波

超聲波為頻率高于20kHz以上的有彈性的機械振蕩，能使食品中的大分子物質發生機械性斷鍵作用和自由基的氧化還原反應，導致其共價鍵斷裂，分子降解，結構改變[23]。比如唐傳核等[24]用15kW超聲波處理大豆分離蛋白，結果顯示其出現了部分二硫鍵締合及分子重排現象，三級結構改變。李振興[25]利用30kHz、800W、50℃的超聲波處理南美白對蝦4min，發現蝦提取物的免疫活性有明顯降低，經免疫印跡實驗得出蝦主要過敏原Pen a 1的IgE識別的蛋白質條帶減弱，這可能由于Pen a 1被降解為分子質量較小的多肽，破壞了過敏原Pen a 1的IgE的識別位點。本課題組開展的超聲波對牛乳過敏原β-乳球蛋白影響的研究，發現β-乳球蛋白的一級結構表現較強的穩定性，二級和三級結構僅發生微弱變化，具有降低該β-乳球蛋白致敏性的作用[26]。目前超聲加工控制食物過敏原的工作剛起步，該技術對過敏原蛋白結構的影響值得深入探討。

2.1.4 高壓脈沖電場

高壓脈沖電場處理食物采用高電壓(0～50kV)、短脈沖及溫和溫度，具有傳遞均勻、作用時間短、產熱少、能耗低、對食物的營養成分和感官特性影響小等優點。目前利用高壓脈沖電場對食物過敏原進行處理，結果顯示過敏原蛋白的疏水性變化最為明顯。比如Li等[27]研究發現隨著脈沖強度、脈沖寬度增大及脈沖時間延長，大豆分離蛋白的疏水性和巰基含量都增加。但當脈沖強度為40kV/cm、樣品流速為40mL/min，疏水性和巰基含量略有降低。張鐵華等[28]用高壓脈沖電場的方法處理蛋清蛋白后，發現蛋清蛋白的疏水性先隨脈沖電場強度的增加而增大，但當脈沖電場強度大于30kV/cm后，其疏水性下降。在2011年，趙偉等[29]利用高壓脈沖電場處理蛋清蛋白得到相同的結果，其原因是隨著高壓脈沖電場處理強度(電場強度和處理時間)增加，蛋白質表面疏水基團和巰基增多，當外露的疏水基團增加到一定程度時，蛋白質分子間發生疏水相互作用，發生“疏水塌陷”，蛋白質表面疏水性下降，蛋白質聚集。此外，Chung[30]、Yang[31]等對脈沖紫外線方面的研究比較深入，他們分別對不同的食物過敏原進行脈沖紫外線處理，獲得非常理想的成果，研究發現當花生過敏原蛋白經脈沖紫外線處理4min，Ara h 1和Ara h 3的IgE的結合能力降低了6～7倍，隨著時間和光強度的增加，Ara h 2的致敏性也大大降低；大豆蛋白提取液經脈沖紫外線處理，小分子蛋白(14～50kD)含量降低，而大分子蛋白(150～250kD)含量增加，明顯有聚合現象[32]；蝦的過敏原原肌球蛋白的致敏性也明顯受到脈沖紫外線處理的影響[33]。而脈沖紫外線對過敏原蛋白結構的影響尚未有相關報道，有待進一步研究。本課題組的研究表明，牛乳過敏原β-乳球蛋白受到脈沖電場作用后，一級和二級結構均受到不同程度的影響，蛋白部分降解且α-螺旋和不規則卷曲發生相互轉化。變化最為明顯的是三級結構，隨著脈沖數的增大，疏水基團暴露程度增大，色氨酸熒光強度降低。但遺憾的是，β-乳球蛋白受到脈沖電場作用后，其致敏性變化并沒有規律性[26]。近年來，高壓脈沖電場的加工技術手段漸漸被研究人員采用，高壓脈沖電場處理食物過敏原研究鮮見文獻報道，但仍然是值得高度關注的新技術。

2.2 化學方法

2.2.1 糖基化

糖基化是通過美拉德反應對過敏原蛋白進行改性的一種方法，即碳水化合物與蛋白質分子的氨基或羧基以共價鍵相結合。碳水化合物能夠掩飾或破壞過敏原蛋白分子上的致敏表位，從而改變其致敏性。

目前應用糖基化法改變過敏原致敏性已有很多報道。比如，Hattori等[34]研究褐藻酸低聚糖、磷酸基低聚糖對牛奶中主要過敏原β-乳球蛋白的影響，發現當β-乳球蛋白分別與褐藻酸低聚糖、磷酸基低聚糖的比例是1:6、1:8時，β-乳球蛋白的二級、三級結構雖沒有發生很大變化，但糖基化產物使體內IgE[35]和T細胞[36]的水平得到降低，這說明加入的糖類掩飾了過敏原蛋白的致敏表位和抗體的識別位點，形成的糖基化產物明顯降低β-乳球蛋白的致敏性。Bu等[37]運用響應面法對不同蛋白質/糖比例、溫度及時間進行條件優化，確定對乳清致敏性影響的最佳條件，得出當乳清與葡萄糖的比例為1:5.96、溫度52.8℃、作用時間78h時，α-乳白蛋白的致敏性下降95.22%，研究者推測由于美拉德反應，α-乳白蛋白的構象結構發生很大程度的改變，導致其致敏性降低。李慶麗等[38]選取麥芽糖、葡萄糖與蝦過敏原發生美拉德反應后，蝦過敏原分子質量增大，麥芽糖、葡萄糖使蝦的過敏原免疫活性分別降低了約60%和10%。而Jiménez-Saiz等[39]研究發現，當葡萄糖與雞蛋過敏原卵白蛋白的比例是1:0.05時，會產生高聚物，隱藏或改變了過敏原表位，使卵白蛋白與IgE的結合能力和消化能力降低。本課題組開展干法狀態下卵白蛋白糖基化對其結構與致敏性影響的研究，結果表明，糖基化降低了卵白蛋白的IgE結合能力，IgE結合能力的變化主要是構象的變化而不是糖基引入導致的線性表位的破壞，糖基化后二級結構β-折疊和β-轉角的變化是導致其致敏性改變的主要原因[40]。總之，糖基化是食品加工中常見的一種現象，探索其對過敏原的影響具有重要的現實意義。

2.2.2 甲基化修飾

蛋白質是由多種氨基酸組成，賴氨酸和精氨酸的殘基上有甲基化位點。組蛋白合成后，以硫代腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在組蛋白甲基轉移酶的催化下，將甲基轉移到蛋白質的賴氨酸或精氨酸殘基上，改變過敏原蛋白質的結構組成，影響其致敏性。如Mine等[41]發現經甲基化處理的卵轉鐵蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶的IgE的結合能力分別降低了22.6%、18.6%和23.8%。Fujita等[42]研究魚類過敏原卵黃蛋白有很強的耐消化能力，經羧甲基化修飾后，魚類過敏原肽鍵斷裂和內部結構發生變化，其消化能力降低，與IgE的結合能力也降低。

有關甲基化修飾過敏原蛋白的研究并不多，從蛋白的生物合成過程而言，這是蛋白后修飾的一種方式，筆者認為將食物過敏原蛋白進行甲基化，其安全性值得進一步評估。

2.2.3 蛋白質磷酸化

蛋白質磷酸化被認為是提高蛋白功能特性的有效手段。大多數蛋白質在絲氨酸和蘇氨酸殘基上磷酸化，有的酪氨酸上也有磷酸化位點。磷酸根基團可以增加蛋白質的電負性，提高蛋白質分子之間的靜電斥力，使其更易分散，因而提高其溶解度，改善其乳化性、起泡性。比如，熊柳等[43]用三聚磷酸鈉對花生分離蛋白進行磷酸化改性，發現在44.85℃和pH8.24的條件下，加入7.77%的三聚磷酸鈉，花生蛋白的吸水性、持水性、乳化性等特性都有不同程度提高。磷酸根基團對過敏原蛋白的修飾可以影響其各功能特性，也可能會引起其致敏性的改變。除此以外，目前也有用其他化學試劑對食物過敏原進行修飾的研究報道，如Marzban等[44]用二硫蘇糖醇處理蘋果中的主要過敏原Mal d 2，結果發現其α-螺旋結構展開，二硫鍵斷裂，破壞了蛋白質的二級、三級結構，使IgE結合表位暴露，致敏性增加。

以上綜述表明，化學方法對食物過敏原的影響主要通過修飾蛋白質的氨基酸殘基來實現，這都可能會影響到過敏原的表位結構。因此，化學方法控制過敏原致敏性具有重要作用，值得進一步探索。

2.3 酶法改性

2.3.1 酶交聯

目前普遍認為，蛋白質的致敏性與其空間結構有著密切的關系。而酶交聯則是利用一種或多種酶催化蛋白質內部各多肽鏈之間，或催化蛋白質各分子之間形成共價鍵而發生交聯反應，改變了原有蛋白質的空間結構，形成大的聚合物，從而使過敏原蛋白的致敏性有所變化。如Chung等[45]用過氧化物酶處理烘烤過的花生，發現與未用酶交聯烘烤花生相比，花生過敏原與IgE的結合能力減弱。在此基礎上，Chung等[46]又用多酚氧化酶交聯花生中的Ara h 1、Ara h 2兩種主要過敏原，交聯后的蛋白單體含量均有所減少，高聚物含量增加，同時，交聯物與IgE結合能力也有所降低。Leszcyńaka等[47]則發現，經轉谷氨酰胺酶交聯后，小麥麥谷蛋白的致敏性降低30%。這可能由于轉谷氨酰胺酶改變了過敏原的內部結構，掩埋了過敏原表位，使其致敏性降低。本課題組的初步研究結果顯示，多酚氧化酶交聯后的乳清蛋白，其乳化性及其穩定性和起泡性及其穩定性均發生了較大變化，交聯后的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白以及β-酪蛋白的抗原性明顯降低，顯示了多酚氧化酶交聯過敏原蛋白并降低其致敏性的趨勢[48]。總之，利用酶交聯技術研究食物蛋白結構與其過敏原性關系，將為降低食物過敏原的致敏性提供全新的科學理念，值得深入研究。

2.3.2 酶降解

酶降解是通過斷裂酰胺鍵破壞其一級結構而產生小分子肽段來降低其致敏性，也可通過改變過敏原的致敏性表位的三維結構來降低其致敏性[23]。如聶君等[49]用蛋白水解酶菠蘿蛋白酶、非蛋白氧化酶葡萄糖氧化酶分別處理蛋清，得出用菠蘿蛋白酶處理后的蛋清致敏性最低，致敏性降低約79.63%，其效果是非蛋白氧化酶葡萄糖氧化酶和高溫加熱處理(121℃、10min)的3倍。這是單一酶對雞蛋過敏原的影響，多種酶的聯合影響也有相關報道，Fritsche等[50]用堿性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶共同作用于雞蛋全液，結果得出其致敏性顯著降低。Koppelman等[51]對花生過敏原的研究中發現，用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理時，花生的Ara h 1、Ara h 3能迅速被胃蛋白酶消化，而Ara h 2、Ara h 6則需要在較高的胃蛋白酶濃度條件下才能被消化。如，沈小琴等[52]用堿性蛋白酶水解乳清蛋白，發現α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性分別降低了50.02%和99.72%。在酶降解中，堿性蛋白酶的應用范圍較廣，主要由于堿性蛋白酶是內肽酶，水解蛋白質分子內部的肽健，生成分子質量較小的多肽，破壞分子內部的過敏原表位結構，影響食物致敏性高低。

目前，利用酶水解牛乳生產低致敏嬰兒奶粉的技術已廣泛應用于工業生產中，在一定程度上降低了牛乳對過敏體質兒童的危險性。然而牛乳在酶解過程中，不可避免地會產生苦味肽，這大大影響了牛乳原有的風味，制約著低致敏奶粉的發展。與此同時，利用酶改性技術研發其他種類低致敏食品尚處于起步階段。總之，酶法改性食品蛋白技術可以降低甚至消除食品蛋白的過敏原性，為低致敏蛋白/蛋白食品的研發提供了一個很好的思路，具有廣闊的應用前景。

2.4 生物方法

2.4.1 基因工程

利用基因工程的方法主要是對編碼過敏原蛋白的基因序列進行突變，修飾相應的序列和結構，改變其線性表位和構象性表位組成，從而達到改變致敏性的目的。比如，Herman等[53]報道，采用基因抑制的方法處理大豆過敏原Gly m Bd 30K，結果成功表達出非致敏性的蛋白。Sathe等[54]采用基因沉默技術同樣消除了蘋果的過敏原Mal d 1的致敏性。當然也可以通過基因重組的方法改變過敏原的致敏性，比如，易海濤等[55]將花生的主要過敏原Ara h 2的3個最主要的IgE抗原表位斷開，再進行重新組合使其次序顛倒，結果發現與未突變的Ara h 2相比，其免疫反應性有明顯降低。此外，楊振煌[56]采用基因重組技術對苦蕎過敏原Fag t 1的核苷酸序列進行重新構建，并將重組分子在原核載體中表達獲得幾種重組蛋白，這些重組蛋白由于失去天然蛋白結構而喪失了IgE結合能力，免疫活性降低了約90%。

基因工程能夠高效地改變過敏原的致敏性，但由于轉基因食品普遍受到公眾的排斥，因此，對于基因工程能否實際應用于食物致敏性的消除，還需進一步討論。

2.4.2 發酵

發酵可以改變食品中各組分含量，通過微生物及其分泌的酶系作用，可以把不溶性高分子物質分解成為可溶性低分子化合物。因此，對于導致機體產生過敏反應的大分子蛋白質必然會受到影響。在1999年，Lucjail等[57]就采用嗜熱乳酸菌和嗜溫乳酸菌發酵滅菌乳，結果發現牛乳中的β-乳球蛋白的致敏性降低。在2001年，Besler等[58]也用嗜熱、嗜溫的乳酸菌對牛奶進行發酵，同樣發現牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的致敏性降低90%。近幾年來，發酵方法不斷改進，應用范圍不斷擴大。如Frias等[59]研究L.plantarum對大豆蛋白的致敏性影響，結果發現L.plantarum使其致敏性降低了4%。Leszczyńska等[60]將乳酸桿菌和酵母菌混合，分別通過同型和異型乳酸發酵研究對小麥粉的過敏蛋白的影響，結果發現小麥醇溶蛋白的致敏性顯著降低，且小麥中總過敏原的IgE結合能力降低20%。Sen等[61]用德式乳桿菌發酵雞蛋的卵白蛋白，發現其IgE的結合能力降低50%，他們認為可能由于過敏原蛋白分子內二硫鍵的變化，引起結構改變，蛋白分子發生降解。總之，發酵降低食物致敏性具有明確的效果，對于輕度過敏患者選擇發酵食品是一個不錯的解決方案，但完全消除還是有一定困難。針對發酵食品，開展食物過敏原致敏性控制研究具有明顯的應用價值。

3 結 語

近10年來，非熱加工技術已經成為國內外食物加工技術研究的熱點，它具有操作簡單、營養成分損失少、保持原有的感官特性、節能環保等優勢。因此，非熱加工方法越來越廣泛應用于食物過敏原的研究中。隨著研究的深入，發現有些非熱加工僅僅停留在對過敏原結構的影響上，而沒有對其致敏性作進一步研究。同時還發現每種方法都有其局限性，所以各加工方法之間的聯用技術也成為今后一個新的研究發展方向。另外，對食物過敏原的研究大部分局限在實驗階段，僅有酶解技術應用到實際生產中，但無法滿足實際需求。迄今為止，我國還沒有自主知識產權的脫敏食品，過敏患者的安全飲食還有很多問題需要解決，而利用非熱加工來降低食物過敏原的致敏性，為脫敏食品的生產提供了一條新的探索途徑并顯示了強大潛力。

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