一株產γ-氨基丁酸植物乳桿菌MJ0301培養基的優化

黃桂東，毛 健,,*，姬中偉，傅健偉，鄒慧君

(1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經系統一種重要的抑制性神經遞質[1]，具有降血壓[2]、改善腦部血液循環[3]、治療癲癇[4]、控制哮喘[5]、精神安定[6]等生理活性。GABA既是一種具有顯著藥理作用的藥物，又被視為具有保健功能的新型功能性因子，在食品、醫藥等領域具有十分樂觀的應用前景[7]，因此，GABA的合成已引起了人們的廣泛關注和重視。

GABA雖然在動植物體內均分布廣泛[8-9]，但其天然存在量低，從天然組織中分離提取難度較大[10]。目前獲得GABA的方法主要是化學合成法和生物法兩類，其中生物法包括植物富集法和微生物發酵法[11-12]。化學合成法反應速度快、得率高，但反應條件苛刻，且有化學物質殘留，脫除產品中有毒成分比較復雜、成本高、安全性差，其在食品加工中的應用受到了限制[11]。雖然GABA的植物富集法制備工藝比較簡單，但GABA得率較低，不適于大規模生產GABA[10]。微生物發酵法的早期研究是以大腸桿菌作為生產菌進行的[13]。在發酵培養過程中，利用大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的脫羧作用，將L-谷氨酸轉化為GABA，再進行分離純化[14]。林少琴等[15]以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯劑，固定化大腸桿菌谷氨酸丙酮粉生產GABA，雖然具有較好的熱穩定性，但安全性較差。除大腸桿菌外，含有谷氨酸脫羧酶的酵母[16]、乳酸菌[17]等也可用于GABA的生產。近年來，乳酸菌被看作是一種食品安全級(generally regarded as safe，GRAS)的微生物，在食品工業中的應用非常廣泛且歷史悠久，乳酸菌在人和動植物體內定殖并產生大量有益健康的成分，被譽為重要的、必不可少的益生菌[18]。其生產的GABA更具有安全性且容易實現商業化生產，具有較好的應用前景。因此，本研究選用實驗室保存的一株植物乳桿菌MJ0301，對其進行培養基成分優化，以提高其GABA產量。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃酒發酵液中分離出的植物乳桿菌Lactobacillus plantarumMJ0301 本實驗室保存。

1.2 培養基

MRS液體培養基[19]：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、檸檬酸三胺2g/L、K2HPO42g/L、乙酸鈉5g/L、硫酸鎂0.1g/L、硫酸錳0.05g/L、吐溫-80 1mL/L，調節pH值為6.2～6.4，121℃條件下滅菌20min。

斜面保藏培養基：同MRS液體培養基的配方，另加瓊脂20g/L。

1.3 GABA的測定方法

采用氨基酸自動分析儀進行測定[20]。取1mL發酵液，加入4mL 10%的三氯乙酸(TCA)，振蕩均勻后，靜置30min，經雙層濾紙過濾后，取1mL發酵液，于10000r/min離心10min，取0.5mL上清液于樣品瓶中待用。經氨基酸自動分析儀分析，得出GABA產量。

1.4 生長曲線的繪制

取一環新鮮的斜面菌種，接種于裝有100mL MRS發酵培養基的三角瓶中，于30℃恒溫培養箱中靜置培養24h，每隔2h取一次樣品，以空白培養基為對照，在波長600nm處測定其吸光度，以培養時間為橫坐標，A600nm值為縱坐標，繪制菌體的生長曲線。

1.5 培養基成分的單因素試驗

考察培養基中碳源、氮源、底物質量濃度、吐溫-80等因素對菌株GABA產量和生長情況的影響，確定最適宜的培養基成分。

分別選擇20g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸鈉作為唯一碳源進行試驗。在確定了碳源種類的基礎上，以葡萄糖為唯一碳源，質量濃度分別為5、10、15、20、25g/L的MRS培養基，考察了葡萄糖質量濃度對乳酸菌生長及GABA產量的影響。

以MRS液體培養基為基礎，分別采用10g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、硫酸亞鐵銨作為唯一氮源進行試驗，考察不同氮源對乳酸菌生長及GABA產量的影響。在確定了氮源種類的基礎上，分別以胰蛋白胨和牛肉膏、胰蛋白胨和酵母膏、胰蛋白胨和蛋白胨作為復合氮源，該復合氮源成分的質量比是1:1，其質量濃度為10g/L，考察其對乳酸菌生長及GABA產量的影響。

在確定了碳源及氮源種類及其添加量的基礎上，考察K2HPO4質量濃度(1、1.5、2.0、2.5、3.0g/L)、吐溫-80添加量(0.5、0.75、1、1.25、1.5、2mL/L)和底物L-谷氨酸鈉質量濃度(0、5、15、20、25g/L)對乳酸菌生長及GABA產量的影響。

1.6 響應面分析法優化培養基

采用響應面分析方法(RSM)對培養基的組成進行了優化。根據以上單因素試驗的結果選取3個主要因素(葡萄糖、復合氮源、L-谷氨酸鈉)進行響應面試驗設計，并用Design-Expert軟件對試驗數據進行回歸分析。根據Box-Behnken的中心組合設計原理，以葡萄糖、復合氮源、L-谷氨酸鈉3個因素為自變量，以GABA產量為響應值，設計了三因素三水平的響應面分析試驗，共有17個試驗點。

2 結果與分析

2.1 菌株MJ0301的生長曲線及GABA初始生成量

圖1 菌株MJ0301生長曲線圖Fig.1 The growth curve of Lactobacillus plmltarum MJ0301

由圖1可知，該菌的對數生長期是2～10h。菌株MJ0301的初始GABA生成量由氨基酸自動分析儀完成。菌株MJ0301發酵液的處理方法參照文獻[17]進行。經測定后得出菌株MJ0301的初始GABA生成量為143mg/L。

2.2 培養基成分的單因素試驗結果

2.2.1 碳源種類及其質量濃度的確定

2.2.1.1 不同碳源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

添加了20g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸鈉作為唯一碳源后，乳酸菌MJ0301的生長及GABA的產量如圖2所示，碳源的種類對乳酸菌的生長及GABA的產量有較大的影響，以葡萄糖為碳源時，發酵液中的GABA產量為134.5mg/L，明顯高于其他碳源，故選擇葡萄糖為最佳碳源。

圖2 不同碳源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and yield of GABA

2.2.1.2 葡萄糖質量濃度對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

進一步考察了葡萄糖質量濃度對乳酸菌生長及GABA產量的影響，不同葡萄糖質量濃度條件下，乳酸菌MJ0301的菌體生長量及GABA產量如圖3所示，葡萄糖質量濃度對乳酸菌生長及GABA的產量有較大的影響。隨著葡萄糖質量濃度的增大，發酵液中菌體含量增加，葡萄糖質量濃度增加至10g/L后，菌體數量基本無變化，但GABA產量有較大幅度的減少，分析這一現象的原因，可能是糖分過多，菌體代謝活動旺盛，產生有機酸，使pH值降低，引起菌體衰老。所以選擇10g/L的葡萄糖作為最佳碳源質量濃度。

圖3 不同葡萄糖質量濃度對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and yield of GABA

2.2.2 氮源的種類及其質量濃度的確定

2.2.2.1 不同氮源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

分別用10g/L的牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、硫酸亞鐵銨作為唯一氮源進行試驗，考察了不同氮源對乳酸菌生長及GABA產量的影響，結果如圖4所示，氮源的選取對于菌株MJ0301的菌體量及GABA的產量有很大的影響。當以無機氮源(硫酸亞鐵銨)作為唯一氮源時幾乎沒有GABA生成，而且菌體量很低，說明該菌不能直接利用無機氮源；添加有機氮源作為唯一氮源時，菌體量都較高，其中又以胰蛋白胨為唯一氮源時，GABA產量最高。因此選擇胰蛋白胨作為最佳氮源。

圖4 不同氮源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.2.2 復合氮源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

以胰蛋白胨和牛肉膏、胰蛋白胨和酵母膏、胰蛋白胨和蛋白胨作為復合氮源，考察其對乳酸菌生長及GABA生成量的影響，結果如圖5所示，胰蛋白胨和酵母膏的質量比為1:1，質量濃度分別為10g/L時，GABA的產量明顯高于另外兩種組合。可能是因為酵母膏中含有豐富的氨基酸、核酸、維生素等物質，能夠為菌體生長代謝提供所必需的生長因子。因此，本試驗選擇胰蛋白胨和酵母膏作為復合氮源。

圖5 不同復合氮源對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.5 Effect of mixed nitrogen sources on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.3 K2HPO4對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

一般情況下，微生物從無機磷化合物中獲得磷，在體內同化為有機磷化合物，磷酸根在能量代謝中起著重要的調節作用，同時磷是構成磷酸和磷脂的主要組成成分，并參與構成許多酶的活性基團。鉀雖然不參與細胞結構物質的組成，但能作為許多酶的激活劑，促進糖類代謝。從離子平衡角度來看，培養基中添加一定質量濃度的K2HPO4可以對乳酸菌培養體系中pH值變化起到了一定的緩沖作用。本實驗考察了不同質量濃度K2HPO4對乳酸菌生長及GABA產量的影響，結果如圖6所示，K2HPO4的質量濃度為2g/L時，GABA產量最高，故設置優化培養基中K2HPO4的質量濃度為2g/L。

圖6 不同質量濃度的K2HPO4對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.6 Effect of K2HPO4 concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.4 吐溫-80對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

吐溫-80是一種很好的乳化劑和分散劑，可以使培養基中的成分更加均勻，促進菌體的生長。本實驗考察了不同體積分數的吐溫-80對菌體生長及GABA產量的影響，結果如圖7所示，吐溫-80添加量在為1mL/L時，GABA的產量達到最大(對于之前鋸齒狀的實驗數據可能是由于實驗的操作誤差導致，在經過重復實驗后得到上述結果)。

圖7 吐溫-80添加量對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.7 Effect of Tween-80 concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.2.5L-谷氨酸鈉對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響

谷氨酸質量濃度增大可使GABA支路中碳流量增加，并調節谷氨酸脫氫酶(glutamate decarboxylase，GAD)活性。L-谷氨酸鈉質量濃度對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響如圖8所示，L-谷氨酸鈉質量濃度對菌株MJ0301產GABA有較大的影響。隨著L-谷氨酸鈉質量濃度的增大，GABA的產量也隨之增加。當L-谷氨酸鈉質量濃度超過20g/L后，菌體濃度基本保持不變，雖然GABA產量依然增加，但是從L-谷氨酸鈉的轉化率上是不斷降低的。因此選擇20g/L為L-谷氨酸鈉的最優質量濃度。

圖8 不同質量濃度的L-谷氨酸鈉對菌株MJ0301生長及GABA產量的影響Fig.8 Effect of sodium L-glutamate concentration on the growth of Lactobacillus planltarum MJ0301 and the yield of GABA

2.3 響應面試驗結果與分析

由單因素試驗結果可知，培養基中添加合適質量濃度的葡萄糖、胰蛋白胨和酵母膏對菌株MJ0301菌體生長及GABA生成均有顯著促進作用。而培養基中K2HPO4和吐溫-80的添加雖然對于乳酸菌的生長及GABA產量有一定的促進作用，但影響并不顯著。因此，選擇葡萄糖、復合氮源、L-谷氨酸鈉進行三因素三水平的響應面試驗。結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計方案及結果Table 1 Experimental design and results

對表1試驗數據進行多項擬合回歸，以GABA的產量為因變量，以碳源(葡萄糖)質量濃度、氮源(酵母膏、蛋白胨質量比為1:1)、L-谷氨酸鈉質量濃度為自變量建立回歸方程：

對回歸方程進行方差分析，結果見表2。該方程表達了GABA產量與所選的3個因素之間的關系。回歸方程的決定系數R2為0.9808。GABA與試驗中3個因素的回歸方程的F值為39.65，整體模型的P＜0.0001，表明方程模型極顯著。葡萄糖質量濃度和L-谷氨酸鈉質量濃度對GABA產量的影響極顯著，氮源(胰蛋白胨與酵母膏復合氮源)影響不顯著；交互項中，碳源和氮源，碳源和L-谷氨酸鈉的交互影響極顯著，氮源和L-谷氨酸鈉的交互影響顯著；二次項中，碳源、氮源和L-谷氨酸鈉的影響極顯著。同時，圖9直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響。失擬項P＞0.05，表示該方程可以接受，可以利用該回歸方程確定最優的產GABA的培養基成分。

表2 響應面設計的方差分析及回歸方程系數顯著性檢驗Table 2 Analysis of variance for the experimental results of RSM design and statistical significance of each regression coefficient in the RSM model

圖9 各因素交互影響的響應面法立體分析圖Fig.9 Response surface plots showing the interaction effect of factors on the yield of GABA

2.4 植物乳桿菌MJ0301產GABA的優化培養基成分的確定

通過軟件Design-Expert7.1求解方程，給出了產GABA的最優培養基組成為：葡萄糖16.20g/L、復合氮源9.78g/L、L-谷氨酸鈉29.75g/L，理論預測GABA產量為1.60g/L。考慮到實際操作的局限性，培養基中的各種成分修正為：葡萄糖16.0g/L、復合氮源(胰蛋白胨、酵母膏質量比1:1)10g/L、L-谷氨酸鈉30g/L。

為檢驗結果的可靠性，將植物乳桿菌MJ0301接種到修正后的培養基中于同樣條件下培養，測其GABA產量為1.59g/L，與理論預測值基本吻合。

3 結 論

本研究對從黃酒發酵過程中分離得到的一株具有產GABA能力的植物乳桿菌MJ0301進行了發酵培養基的優化，先通過單因素試驗(碳氮源種類及其質量濃度、K2HPO4質量濃度、吐溫-80添加量、L-谷氨酸鈉質量濃度)得到影響植物乳桿菌MJ0301的GABA產量最顯著的3個因素。再利用響應面分析法對這3個因素進行分析，以GABA產量為響應值，得到以下結論：1)通過單因素試驗，得出對植物乳桿菌MJ0301產GABA量影響最大的3個因素是葡萄糖、復合氮源、L-谷氨酸鈉。2)利用響應面分析法設計三因素三水平試驗，分析得到優化的培養基條件為葡萄糖16.0g/L、復合氮源(胰蛋白胨、酵母膏質量比1:1)10g/L、L-谷氨酸鈉30g/L，此時產量達到1.59g/L，比優化前(143mg/L)提高了10.12倍。

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