蛋白質氧化對肉類成熟的影響研究進展

陳茜茜，王 俊，黃 峰，黃 明*

(南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095)

肉類動物在宰后一段時間內，由于肌肉的連續不可逆收縮會形成尸僵，尸僵使肉的食用品質變差。在隨后的低溫(0～4℃)成熟過程中，肌肉的僵直解除、肌肉變軟、系水力提高、風味得到有效改善。然而，在此過程中，脂質和蛋白質極易被氧化，造成肉的品質產生劣變。脂肪氧化會促進肌紅蛋白氧化，導致肉褪色并產生酸敗味，這方面的內容已經被廣泛研究。但有關蛋白質氧化的研究起步較晚，現在主要集中在臨床醫藥方面，在肉品領域相對較少。在肉的宰后成熟過程中，肌肉組織中的蛋白質在活性氧的攻擊下，結構改變而導致某些功能也發生顯著變化，從而必然會引起肉制品的嫩度、保水性、顏色等品質的劣變[1-2]。本文主要闡述在肉的宰后成熟過程中蛋白質氧化的作用機理，并探討蛋白質氧化對肉類成熟的影響。

1 肉類成熟過程中的蛋白質氧化機制

1.1 蛋白質氧化機制

蛋白質氧化，是指在體內外環境中，蛋白質在自由基及其相關氧化物的作用下，某些特定的氨基酸殘基發生反應，導致結構與功能發生變化，使蛋白質對氧化物的親和力增強，易于水解、聚合、交聯，損害細胞功能甚至導致細胞死亡[3]。蛋白質作為生物功能的主要體現者，廣泛分布于細胞內外，因此是生物體內最易被氧化的對象之一。生物體內一些金屬或酶催化的氧化反應，如脂質氧化、光敏劑、離子輻照、H2O2激活高鐵肌紅蛋白以及其他化學和生物過程都可以產生反應性氧系(ROS)，ROS主要包括超氧陰離子自由基(?)、羥自由基(?OH)、過氧化氫自由基(HO2?)、單氧(O2)、次氯酸(HOCl)和一些活性的酮基和醛基[4-5]。多數情況下啟動蛋白質氧化的自由基都是?OH。見圖1。

?OH的化學性質很活潑，可以迅速氧化氨基酸側鏈。?OH主要攻擊含不飽和鍵和巰基的氨基酸，可以將組氨酰殘基氧化成天冬氨酰殘基、將脯氨酰殘基氧化成谷氨酰殘基等。Sharp等[7]測得不同氨基酸殘基與羥基自由基反應的相對活性順序為：半胱氨酸＞色氨酸、酪氨酸＞甲硫氨酸＞苯丙氨酸＞組氨酸＞異亮氨酸＞亮氨酸＞脯氨酸。

圖1 在體內和體外?OH產生的機制[6]Fig.1 Mechanisms of hydroxyl free radical production in vitro and in vivo[6]

根據目前的研究可將ROS介導蛋白質的氧化分為直接和間接兩種方式。直接介導，即ROS對主鏈、脂肪族側鏈氨基酸殘基或者芳香族側鏈氨基酸殘基發起攻擊，經歷去氫、電子傳遞、加成、斷裂和重排、二聚、歧化和取代的歷程，使蛋白質氧化。間接介導，指ROS先介導脂質過氧化和非酶糖基化反應，產生的脂質過氧化產物等中間產物隨后與蛋白質反應，導致蛋白質羰基化產物和蛋白質-蛋白質交聯物的形成[8]。

1.2 肉類成熟過程中的蛋白氧化

蛋白質是機體一切細胞的基本構成物質，在生命活動中起著催化、轉運、調節、貯存、免疫等作用。蛋白質在畜肉、禽肉等肉類產品中含量很高，因此蛋白質氧化現象普遍存在于肉類宰后成熟過程中。在正常生理條件下，ROS的產生和清除是動態平衡的，但隨著機體的衰老，尤其在處于應激和疾病狀態時，會有一部分ROS未能被及時清除。這部分的ROS會損傷蛋白質、核酸以及脂類等生物分子。

1996年，Srinivasan等[9]曾提出假設，認為在肉類成熟過程中，脂類的氧化產物可以引發蛋白質的氧化。后來有研究證實脂質過氧化產物如4-羥基壬烯醛(hydroxynonenal，HNE)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)確實可以與賴氨酸、組氨酸及半胱氨酸殘基共價結合[10]。蛋白質氧化與脂肪氧化具有類似的自由基鏈式反應過程，包括起始、傳遞、終止3個階段?？赡艿淖饔脵C制[11]如下(L代表脂質，P代表蛋白質)：

引發：L→ L?；傳遞：L?＋ O2→ LOO?；抽氫：LOO?＋ P→LOOH ＋ P?(—H)；延伸：LOO?＋ P →?LOOP；復合：?LOOP ＋ P ＋ O2→?POOLOOP；聚合：P—P?＋ P?＋ P → P—P—P?＋ P—P—

在不同的氧化體系中，氨基酸殘基被氧化的難易程度存在差異。在相同環境條件下，不同的氨基酸殘基的氧化情況差異較大。Park等[12]將肌原纖維蛋白提取物置于肌肉組織中3種不同的氧化體系：鐵離子催化氧化體系(iron-catalyzed oxidizing system，IOS)、脂質氧化體系(lipid-oxidizing system，LOS)及高鐵肌紅蛋白氧化體系(metmyoglobin oxidizing system，MOS)。通過液相色譜對各類氨基酸進行定量分析，結果表明在3種氧化體系中，含硫氨基酸如半胱氨酸和甲硫氨酸最容易被氧化；酪氨酸殘基在IOS體系中較在另外2種體系中更易被氧化，形成酪氨酸-酪氨酸交聯物；在MOS體系中則是丙氨酸、亮氨酸、組氨酸和賴氨酸較易被氧化。而組氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸在金屬離子氧化體系中最容易被氧化[13]。

在ROS介導的蛋白質氧化過程中，氨基酸被氧化的優先程度不僅取決于氧化體系，通常也和蛋白質的類型有關。在乳蛋白的氧化過程中，半胱氨酸優先于色氨酸被氧化，而蛋氨酸則未被氧化[14]。大豆的胰蛋白酶抑制劑和溶解酵素在與次溴酸接觸后活性喪失，這個過程與組氨酸、色氨酸、酪氨酸殘基的氧化修飾有關，而與其他氨基酸如甲硫氨酸的改變無關[15]。

肌肉中的蛋白質氧化會導致芳香族和脂肪族氨基酸的羥基化、芳香族氨基酸殘基的硝基化、巰基基團的亞硝基化、甲硫氨酰殘基的磺化氧化、芳香基團和主要氨基的氯化，還會使一些氨基酸殘基如賴氨酸、脯氨酸、精氨酸等更易轉化形成羰基衍生物[16-17]。在肌肉中，這些變化會造成多肽的降解及肌球蛋白中ATP酶活性的降低，并且促使蛋白質與細胞中其他大分子物質交聯產生聚合物，會對肉類的品質產生影響[18-20]。

2 蛋白氧化對肉類宰后成熟的影響研究進展

由于肌肉組織中含有各種促氧化因子，肉類制品極易被氧化。在肉的宰后成熟過程中，自由基對蛋白質的攻擊會導致氧化程度提高以及肌肉組織抗氧化能力降低[21]，由此會引起很多生化變化，包括氨基酸結構被破壞、蛋白質聚合而造成溶解性下降、相關酶活性下降以及蛋白質消化率降低[2]。這些變化會影響肉的品質如顏色、嫩度、風味、持水力及營養價值。目前關于蛋白質氧化對成熟影響的研究主要集中在肉的品質方面。

2.1 蛋白質氧化與肉類的宰后成熟

對成熟機制的相關研究一直是肉品科學領域的熱點之一。肉類在宰后成熟過程中品質的改善歸功于一些主要肌原纖維蛋白的降解，比如肌聯蛋白、伴肌動蛋白、肌鈣蛋白-T、肌間線蛋白和紐蛋白等。這些蛋白對維持肌原纖維蛋白結構的完整性極為重要，因此在成熟過程中，它們的水解會破壞肌原纖維的完整性，改變肌細胞內的有序結構，進而提高肉的品質。骨骼肌中存在的酶系統對這些蛋白的降解有一定作用，主要包括鈣激活酶、蛋白酶體、溶酶體組織蛋白酶類和細胞凋亡酶類[22]。目前研究最多并得到大多數學者認同的是鈣激活酶在肉宰后成熟過程中的作用。這方面的研究較為深入，但成熟機制仍未被闡明，鈣激活酶系統并不能完全解釋宰后成熟過程中主要骨架蛋白的降解規律。即使在鈣激活酶抑制劑存在的情況下，仍然有肌原纖維蛋白能夠發生降解[23]；另外，鈣激活酶的存在與否與成熟中某些蛋白質的降解沒有關聯。因此，可以推斷肉類宰后成熟是一個多酶體系共同作用的過程，在骨骼肌中存在其他的酶系統也能促進蛋白降解。目前研究指出細胞凋亡效應酶也參與了肉的成熟過程，并且作用不容忽視。在自然成熟條件下，細胞凋亡酶-3的專一性抑制劑對鈣激活酶影響較小，卻能顯著抑制肌間線蛋白、伴肌球蛋白和伴肌動蛋白的降解[24]。已有實驗證實細胞凋亡酶跟鈣激活酶都可以水解一些細胞內共同的蛋白質底物，且細胞凋亡效應酶-3可以降解鈣激活酶的專一內源性抑制蛋白[25]，充分說明細胞凋亡效應酶對成熟過程中肌原纖維蛋白的降解也有貢獻。

肌肉組織中含有亞鐵血紅素、過渡態的金屬離子和各種氧化酶，極易發生氧化反應。不論是肌原纖維蛋白被氧化還是作用于底物蛋白的酶類被氧化，均會對肉類宰后成熟過程產生影響。部分肌原纖維蛋白被氧化后結構改變，對蛋白水解酶的敏感性發生變化，致使其自身的降解程度改變。目前也發現不同濃度的氧化劑對肌原纖維蛋白的降解程度不同，高濃度的氧化劑氧化的肌原纖維蛋白對鈣激活酶的敏感性增強，部分蛋白更易被降解。另外，氧化會導致細胞骨架蛋白的降解變化，破壞胞內壞境，從而影響肉的成熟過程。有關鈣激活酶系統動力學的研究[26]發現離子強度能影響鈣激活酶活性，氧化會改變宰后動物體內的離子水平，使鈣激活酶活性變化進而導致底物的降解發生改變。氧化還能直接破壞鈣激活酶的結構，通過控制鈣激活酶的活性來改變肌原纖維蛋白的降解。因此為了充分地發揮宰后成熟過程對改善肉類品質的作用，對肉的宰后成熟過程中發生的蛋白質氧化進行深入研究是十分必要的。

2.2 蛋白質氧化對肉的品質影響

2.2.1 蛋白氧化對肉色的影響

生鮮肉的顏色是消費者對肉品質量進行評價的主要依據之一，很大程度上影響著消費者的購買欲。肌紅蛋白和血紅蛋白是肌肉中決定肉色的主要色素物質，其中肌紅蛋白的含量和化學狀態對肉的色澤起關鍵性決定作用。

在肉的宰后成熟過程中，肌肉顏色的變化由血紅素存在的狀態以及鐵原子的氧化還原形式所引起的三種肌紅蛋白之間的轉換所決定。肌紅蛋白與氧結合后生成氧合肌紅蛋白，肉色由紫色變為鮮紅色；氧合肌紅蛋白和肌紅蛋白都可以被氧化形成高鐵肌紅蛋白，肉色變暗呈褐色。在肉的成熟過程中，肉色變化主要是高鐵肌紅蛋白在肉表面的蓄積所致的褐變。宰后的輻照會產生自由基，加速蛋白質的氧化，使高鐵肌紅蛋白迅速累積形成難以接受的棕褐色。如果在宰前一段時間持續飼喂VE，則能有效降低肌漿蛋白的氧化程度，延長肉色的保持時間[27]。另外在肉的成熟過程中使用其他一些天然抗氧化劑如花青素、VE、VC處理，可以抑制蛋白質氧化并促進高鐵肌紅蛋白向氧合肌紅蛋白轉變，從而使肉色保持鮮紅[28]。而關于宰后貯存中發生的蛋白質氧化對肉色的影響，近年來研究較多的是生鮮肉的氣調包裝。氣調包裝中O2含量是影響新鮮紅肉的貨架期的重要因素，盡管高氧(50%～70%)會造成脂質氧化，但能顯著維持和延長肉色。另外高含量的CO2(50%～70%)雖然能夠抑制微生物生長，卻會使肉色變暗。因此對于生鮮牛肉，50%O2＋30%CO2＋20%N2的氣調包裝是最合適的貯存方式，在14d內可以有效地維持肉色并保證氧化反應穩定，同時微生物數量控制也在可接受范圍內[29]。

2.2.2 蛋白氧化對嫩度的影響

影響生鮮肉最終嫩度的因素主要包括肌節長度、結締組織含量及肌原纖維蛋白的水解程度[30]。其中嫩度得到改善最主要的原因是肌原纖維蛋白的有限降解[31]。早期的實驗將肌原纖維蛋白在體外用鈣激活酶孵育，結果能完全模擬自然成熟條件下伴肌球蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T等的降解[32]。因此普遍認為，鈣激活酶能控制關鍵蛋白的降解，最終影響肉的嫩度。然而，μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶的活性位點上都有組氨酸和含有巰基的半胱氨酸殘基，這些都是極易被氧化的基團，從而使酶因氧化而失活[33]。

在肉的宰后成熟過程中發生的蛋白質氧化反應主要包括肌原纖維蛋白和相關酶類的氧化，這些氧化都是通過改變肌原纖維蛋白的降解情況，從而影響肉的嫩度。Rowe等[34]曾在牛肉的宰后26h內對其進行輻照處理，結果證實氧化能通過抑制鈣激活酶的活性降低成熟過程中蛋白降解的程度，輻照組剪切力明顯高于未輻照組，且肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的降解產物更少，同時鈣激活酶的自溶程度也較低。另外，Martine等[35]從豬肉肌肉中提取的肌原纖維蛋白置于?OH體系中氧化，SDS-PAGE分析顯示肌球蛋白重鏈和輕鏈條帶顯著減少，而肌動蛋白的降解條帶在氧化劑濃度達到3mmol/L后也存在一定程度的減少。肌球蛋白和肌動蛋白是肌肉中含量最高的蛋白質，作為肌纖維的主要成分對肌肉的收縮功能起著重要作用，因此肌原纖維蛋白的氧化可以降低蛋白質降解程度，造成嫩度降低。

目前的研究表明，蛋白質氧化主要通過兩種機制影響肉的嫩度：1)是肉的嫩化過程中蛋白水解酶活性的抑制與肌球蛋白及肌動蛋白的氧化修飾之間的協同作用，氧化導致的肌球蛋白和肌動蛋白結構改變會降低其對蛋白水解酶的敏感性[34,36]。2)是通過改變肌原纖維蛋白的結構，使蛋白質之間產生交聯而增強肌纖維結構，從而導致肌肉組織硬化，嫩度下降[33]。

2.2.3 蛋白氧化對肉的持水力的影響

肉的持水力是指當肌肉受到外力作用時，其保持原有水分與添加水分的能力。肌肉的持水力會影響肉的食用品質包括滋味、多汁性、香氣等，還會產生PSE肉，造成經濟損失。影響生鮮肉持水力的因素很多，如動物品種、性別和肌肉部位，壓力、飼喂及運輸管理等宰前處理，宰后因素主要包括電擊暈和pH值下降等，蛋白質氧化也對其產生了不可忽視的影響[37]。純化的肌原纖維蛋白在被H2O2氧化后持水力降低，研究[38]發現這與酪氨酸-酪氨酸交聯物的形成有關，揭示了蛋白氧化交聯產物對持水力存在不利影響。μ-鈣激活酶的自溶能促進主要骨架蛋白的降解，從而提高肌肉的持水力，這是由于宰后肌肉中完整的肌間線蛋白將肌原纖維蛋白的收縮轉化為整個細胞的收縮，造成水分流失，所以肌間線蛋白降解程度越高，滴水損失就越小。同時，整聯蛋白的降解能夠促使細胞膜和細胞骨架之間的水通道形成，使肌肉持水力降低[39]。氧化能抑制主要骨架蛋白的降解并且會降低μ-鈣激活酶的自溶程度[34]，因此在肉的宰后成熟過程中蛋白質氧化會導致滴水損失加重而使肌肉的保水能力下降。然而持水力與蛋白氧化程度間的直接聯系還有待深入探究。

2.2.4 蛋白氧化對肉的營養品質的影響

肉類是人類必需氨基酸的重要來源，包括無法從植物性食物中獲取的氨基酸。肌肉中蛋白質的氧化對食品營養和消費者健康方面潛在的影響越來越被重視。在蛋白質被氧化形成羰基的過程中，一些必需氨基酸如賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸結構上會發生不可逆轉的氧化修飾，從而導致蛋白質功能喪失，因此可以證實蛋白質氧化對肉中蛋白質的營養價值會產生不良影響[12]。氧化后的肌球蛋白和肌動蛋白被木瓜蛋白酶水解的程度降低，這是由精氨酸和賴氨酸的羰基化造成的[35]。然而，羰基的形成對肉制品營養價值的損害程度尚未見報道。

除了造成必需氨基酸的損失，蛋白質氧化還會影響蛋白質的消化率從而降低其營養價值。氧化程度較低時，蛋白質結構會發生微小的變化使其更易被蛋白酶識別而提高水解速度。但當氧化程度較高時，蛋白質分裂產物和特殊氨基酸側鏈的降解將會改變識別位點，從而降低蛋白水解程度[40]。另外蛋白質氧化程度與酪氨酸水解活性之間呈顯著的負相關[41]，羰基-氨基縮合反應也能促進蛋白質的交聯和分裂，從而影響肌球蛋白和肌動蛋白的消化率。

氧化引起的蛋白質消化率降低不僅降低肉的營養品質，而且會損害人體健康。未被水解的氨基酸會被腸道里的菌群發酵，生成苯酚和甲酚，提高患結腸癌的幾率[42]。

3 結 語

目前有關肉成熟過程中蛋白質氧化機理及其對品質的影響的研究已經取得一定成果，也已證實氧化所導致的蛋白質結構的變化(包括羰基化和硝基化)會降低肉制品的營養價值和消化率，但具體的機制和影響程度還有待深入探究。另外，在肉的成熟過程中，肌原纖維蛋白和酶被氧化后，底物蛋白的結構變化、降解情況以及酶的活性變化尚未被闡明，而這些方面的近一步研究可以豐富和發展肉的成熟理論，為充分發揮肉的成熟潛能提供理論依據，對提高肉的食用品質和營養價值具有重要的現實意義。

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