黑米花青苷復(fù)方膠囊對實驗性肝損傷的保護(hù)作用

路宏朝，王楊科，李麗霞，張 濤,2，李新生，王 琦,2,*

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

據(jù)古文獻(xiàn)記載，黑米具有滋陰補(bǔ)腎、健脾肝、明目活血之功效，因此黑米又有 “補(bǔ)血米”、“長壽米”的美稱[1]，其顏色由花青苷類物質(zhì)在米皮和胚乳上沉積而形成。黑米花青苷是花青啶與各種糖以糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷，存在于黑稻的果實、莖、葉器官的細(xì)胞液中[2-3]，屬于黃酮多酚類化合物，具有多種營養(yǎng)和藥理作用[3-8]。Zhang Mingwei等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑米的抗氧化作用與其中所含的黃酮和花青苷類物質(zhì)關(guān)系密切。錢松[10]研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷素對機(jī)體具有促進(jìn)免疫的活性和重要的免疫調(diào)節(jié)作用。侯方麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷能顯著降低CCl4肝損傷小鼠的肝酶活性，減輕對肝組織病理學(xué)損傷，表現(xiàn)明顯的護(hù)肝作用。因此，黑米花青苷作為一種較安全的天然色素資源，在食品和醫(yī)藥方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。

本項目前期已研制出黑米花青苷復(fù)方膠囊[14]，為研究其在肝臟損傷中起到保護(hù)作用，通過建立小鼠CCl4肝損傷病理模型，采用該藥物進(jìn)行治療，初步探索研究黑米花青苷復(fù)方膠囊在CCl4肝損傷中起到的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑米花青苷復(fù)方膠囊由陜西省資源生物重點實驗室和陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心研制并提供，有效成分：黑米花青苷、二苯乙烯苷、菌多糖。低劑量：3.098mg/粒；高劑量： 88.339mg/粒[14]。助懸劑：大豆油。

昆明小鼠，體質(zhì)量18～22g，雄性，體質(zhì)健康，毛色光滑雪白，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(陜動字第08-005號)。

考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒北京科盈美科技有限公司。

玻璃勻漿管、微量移液器 德國Eppendorf公司；臺式離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器公司、N772可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器公司；680型酶標(biāo)儀 美國伯樂公司；2215型石蠟切片機(jī) 德國徠卡公司；DP20奧林巴斯顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組

將動物隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、助懸劑Ⅰ組、助懸劑Ⅱ組、低劑量組、高劑量組，每組10只，置于通氣良好的室內(nèi)給予充足食物進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制

分別將低劑量藥物和高劑量藥物溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為0.4mg/mL和0.6mg/mL的混合劑，0～4℃冷藏備用；將大豆油配制成質(zhì)量濃度為0.25mg/mL混合劑Ⅰ和0.15mg/mL的混合劑Ⅱ。

1.2.3 造模及給藥

采用CCl4造成肝損傷模型，分別給模型組、低劑量組、高劑量組每只小鼠腹腔注射20%的四氯化碳橄欖油0.1mL，2次/周。造模與給藥同時進(jìn)行，正常組、模型組每天灌胃蒸餾水0.4mL，助懸劑Ⅰ組灌胃混合劑Ⅰ0.3mL，助懸劑Ⅱ組灌胃混合劑Ⅱ0.3mL，低劑量組灌胃低劑量藥物0.4mL(相當(dāng)于7.57mg/(kg·d))，高劑量組灌胃高劑量藥物0.4mL(相當(dāng)于10.60mg/(kg·d))。5周后，停止腹腔注射和灌藥，處死。

1.2.4 指標(biāo)及測定

取肝臟制備肝組織勻漿液，檢測肝組織中蛋白質(zhì)含量、SOD活力、MDA、GSH和TNF-α水平，均按試劑盒說明操作。

1.2.5 肝臟病理學(xué)檢查

取肝組織用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，普通光鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)通過SPSS11.0 軟件中的ANOVA程序處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝組織勻漿生化指標(biāo)檢測

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

注：a.與正常組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，aa.與正常組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；b.與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；bb.與模型組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 SOD活力/(U/mg pro) MDA含量/(nmol/mL)正常組 56.35±0.77 0.94±0.11模型組 48.13±7.22a 2.53±1.61aa助懸劑Ⅰ組 58.74±5.66b 2.19±0.40aabb助懸劑Ⅱ組 66.83±1.10aabb 1.84±0.63abb低劑量組 63.24±5.29abb 1.23±0.34bb高劑量組 66.75±6.49aabb 1.27±1.26bb

由表1可見，與正常組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中SOD的活性顯著降低，MDA的含量顯著上升；而黑米花青苷復(fù)方膠囊低劑量和高劑量能顯著升高小鼠肝臟中SOD活性，降低MDA的含量；同時，兩助懸劑組相對于正常組，SOD活力和MDA的含量都有所提高。

表2 肝組織中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

表2 肝組織中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

組別 GSH含量/(mg/mL) TNF-α含量/(pg/mL)正常組 3.40±1.12 19.92±4.58模型組 2.66±0.97 20.17±5.58助懸劑Ⅰ組 2.63±0.70 15.54±2.82助懸劑Ⅱ組 2.84±0.36 16.01±1.56低劑量組 4.76±1.64abb 11.79±1.61aabb高劑量組 5.42±0.75aabb 4.78±3.39aabb

由表2可見，與正常組比較，模型組和兩助懸劑組的GSH和TNF-α含量較低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，高劑量和低劑量藥物都能極顯著升高小鼠肝臟中GSH的含量，降低TNF-α的水平。

2.2 肝組織病理變化

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞條索明顯，無變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生(圖1a)。模型組肝索排列雜亂無章，中央靜脈腫脹、充血。肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織大量增生，形成完整的假小葉，界限清楚。肝細(xì)胞腫脹、破裂，肝竇內(nèi)膽汁淤積，炎性細(xì)胞浸潤(圖1b)。助懸劑Ⅰ組和助懸劑Ⅱ組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯變性(如圖1c、1d)。低劑量組肝索不明顯，纖維結(jié)締組織中度增生，形成不完整的假小葉，炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂肪空泡(圖1e)。高劑量組肝索排列有規(guī)律，纖維結(jié)締組織增生較輕，沒有形成完整的假小葉，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，炎性細(xì)胞浸潤和脂肪變性程度都比模型組、低劑量組低(圖1f)。

圖1 各實驗組小鼠肝臟組織形態(tài)(×100)Fig.1 Hepatic tissues of mice from different groups(×100)

3 討 論

CCl4是一種典型的肝臟毒物，是長期以來公認(rèn)的復(fù)制肝損傷動物模型的化學(xué)物質(zhì)。許多研究認(rèn)為CCl4復(fù)制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀、肝功能檢測指標(biāo)、肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性[15]。CCl4在體內(nèi)經(jīng)過藥物代謝酶的作用，如P-450微粒體酶系統(tǒng)，將CCl4去掉一個氯原子，而形成三氯甲烷，即氯仿，則成為肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微粒體的藥物代謝酶系統(tǒng)的劇毒(產(chǎn)生三氯甲基自由基和氯自由基)，引起肝細(xì)胞生物膜的脂質(zhì)過氧化及肝細(xì)胞損害。本實驗采用腹腔注射0.1mL 20% CCl4的方法建立小鼠肝損傷模型，5周后，肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，形成假小葉，肝細(xì)胞腫脹、破裂，并伴有炎性細(xì)胞浸潤。說明本研究成功復(fù)制了小鼠CCl4實驗性肝損傷模型。

本實驗中，低劑量組和高劑量組小鼠肝臟中SOD的活力顯著升高，且隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，表明黑米花青苷復(fù)方膠囊可提高機(jī)體清除自由基的能力。MDA含量的高低直接反應(yīng)肝臟中脂質(zhì)過氧化損傷程度。低劑量和高劑量組都能顯著降低肝臟中的MDA含量，說明黑米花青苷復(fù)方膠囊能夠有效防止肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的還原產(chǎn)物，機(jī)體產(chǎn)生過多的氧自由基能使GSH含量明顯下降[16]。本研究通過測定GSH含量來反映谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的高低。結(jié)果表明，兩種劑量的黑米花青苷復(fù)方膠囊都可以顯著增加GSH的活性，由此可分析，黑米花青苷復(fù)方膠囊保肝作用可能與其抗氧化性有關(guān)，能夠提高SOD和GSH-Px的活性，清除自由基，阻止肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞質(zhì)膜的正常結(jié)構(gòu)，以降低肝細(xì)胞的損傷程度。TNF-α是肝損傷的一種重要炎癥因子，主要由激活的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生[17]。TNF-α也會引起許多與肝損傷有關(guān)的介質(zhì)如IL-1β的出現(xiàn)，同時誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生。另一方面，也可通過誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、誘導(dǎo)NO產(chǎn)生、促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡等途徑引起肝細(xì)胞的損傷。在本實驗中，低劑量組、高劑量組TNF-α水平都顯著下降，說明兩藥物通過減輕炎癥反應(yīng)和阻止氧自由基的產(chǎn)生，對肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。

病理組織學(xué)觀察，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，形成完整的假小葉，肝細(xì)胞腫脹、廣泛性壞死，并伴有嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤。低劑量和高劑量組癥狀都有所減輕，尤其高劑量組顯著地改善肝小葉變性、壞死的范圍和程度，減輕了炎性細(xì)胞的浸潤，進(jìn)一步表明黑米花青苷復(fù)方膠囊對CCl4所致的肝損傷具有保護(hù)作用。

同時，兩助懸劑組與正常組比較，僅助懸劑Ⅱ組的SOD活力顯著升高，MDA的含量與助懸劑Ⅰ組比較有所降低，而對GSH含量和TNF-α水平?jīng)]有影響。組織學(xué)觀察，助懸劑組肝臟無明顯病變，說明它們不影響黑米花青苷復(fù)方膠囊的效果。因此，選用此助懸劑是較為安全的。

綜上所述，黑米花青苷復(fù)方膠囊對小鼠CCl4引起的肝損傷有較好的保護(hù)作用，具體機(jī)制的深入研究尚在進(jìn)行中。

[1]孔令瑤.黑米中生物活性物質(zhì)的研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2008.

[2]曹小勇, 李新生.黑米花色素苷類色素研究現(xiàn)狀及展望[J].氨基酸和生物資源, 2002, 24(1): 3-6.

[3]王鋒, 鄧潔, 譚興和, 等.花色苷及其共色作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2008, 29(2): 472-476.

[4]SEOK H N, SUN P C, MI Y K, et a1.Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars[J].Food Chemistry,2006, 94: 613-620.

[5]王艷龍, 石紹福, 韓豪, 等.中國黑米花色苷研究現(xiàn)狀及展望[J].中國生化藥物雜志, 2010, 31(1): 63-66.

[6]李春陽, 許時嬰, 王璋.葡萄籽原花青素結(jié)構(gòu)單元的紅外光譜分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2005, 24(4): 47-51.

[7]LI xingsheng, LONG shuming, WU sanqiao, et al.Investigation of anthocyanin extraction from black rice and light stability of anthocyanin-containing alcoholic drink[J].CIGR Journal, 2011,13(Special issue): 151-159.

[8]吳三橋, 史隋孝, 丁銳, 等.黑米中花青苷色素的測定方法研究[J].氨基酸和生物資源, 2002, 24(3): 66-68.

[9]ZHANG Mingwei, GUO Baojiang, CHI Jianwei, et al.Antioxidations and their correlation with total flavones and anthocyanin contents in different black rice varieties[J].Agric Sci China, 2005, 38(7):1324-133.

[10]錢松.黑米花青苷對機(jī)體免疫生化功能影響的研究[D].溫州: 溫州醫(yī)學(xué)院, 2009.

[11]侯方麗.黑米花色苷對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其抗氧化機(jī)制[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[12]郭紅輝, 凌文華.黑米花青苷研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā), 2008,29(3): 133-135.

[13]鐘巖, 李澤鴻, 邵明富.黑米色素的提取方法及穩(wěn)定性研究[J].北方園藝, 2008(10): 71-73.

[14]石紹福.黑米花青苷組分分析及軟膠囊研制[D].漢中: 陜西理工學(xué)院, 2011.

[15]WEBER L W, BOLL M, STAMPFL A.Hepatotoxicity and mechaiism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model[J].Critical Reviews in Toxicology, 2001, 33(2): 105-132.

[16]柳茜, 肖俊.當(dāng)歸多糖預(yù)防急性四氯化碳性肝損傷及其作用機(jī)制[J].中國醫(yī)學(xué)研究與臨床, 2006, 4(3): 4-5.

[17]KISHORE R, HILL J R, MCMULLEN M R, et a1.ERK 1/2 and Egr-1 contribute to increased TNF-alpha production in rat Kupffer cell safter chronic ethanol feting[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002, 282(1): 6-15.