分步酶解法制備菜籽降血壓肽

張 艷，劉志偉*

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是被世界衛(wèi)生組織和我國(guó)《高血壓治療指南》規(guī)定的一線抗高血壓藥。其中包括第一代藥物卡利普托，第二代藥物西拉普利、賴(lài)諾普利、福辛普利等，而這些藥物具有副作用強(qiáng)、和其他藥物聯(lián)用產(chǎn)生不良反應(yīng)等缺點(diǎn)[1]，因而，人們對(duì)食源性降壓肽進(jìn)行了大量的研究并發(fā)現(xiàn)[2-7]，來(lái)源于食物蛋白的活性肽沒(méi)有副作用，這些活性肽可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，稱(chēng)為降壓肽或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)。

研究者們已經(jīng)從不同的食物中制備出降壓肽，其中對(duì)大豆降壓肽的研究較為全面和徹底，Donkor 等[8]從發(fā)酵食品酸奶中檢測(cè)出降壓肽，Lee 等[9]制備出了鮪魚(yú)降壓肽。Sivakumar等[10]以羅非魚(yú)為原料制備出了降壓肽。薛照輝[11]用堿性蛋白酶(alcalase)和復(fù)合風(fēng)味酶(flavourzyme)水解菜籽蛋白得到的菜籽肽具有很好的降血壓功能。張偉[12]從花生蛋白中制備出了降血壓肽。本實(shí)驗(yàn)以菜籽蛋白為原料，通過(guò)優(yōu)選蛋白酶定向分步酶解制備出具有降血壓活性的肽，并對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制。

馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)、ACE活性粉末制劑美國(guó)Sigma公司；堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶丹麥Novo公司；胃蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB-L分析天平、FE20pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TDI-5型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ALPHA2-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)博勵(lì)行公司；UV752分光光度計(jì) 美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶活力測(cè)定

蛋白酶活力測(cè)定采用福林-酚法[13]。

1.3.2 酶解工藝流程

配制一定質(zhì)量濃度的菜籽蛋白溶液，水浴加熱至一定溫度，調(diào)節(jié)pH值至第1種酶的最適值，加入一定量的酶(第1種酶)，低速攪拌，用1mol/L NaOH維持pH值恒定，酶解60min，取酶解液置于沸水浴10min以鈍化酶活性，冷卻，調(diào)節(jié)pH值至第2種酶的最適值，加入一定量的酶(第2種酶)，低速攪拌，用1mol/L NaOH維持pH值恒定，酶解60min，取酶解液置于沸水浴10min以鈍化酶活性，4000r/min離心10min，取上清液冷凍干燥。

1.3.3 酶組合的篩選

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶作為分步酶制劑組合篩選對(duì)象。選取底物菜籽蛋白的質(zhì)量濃度為5g/100mL、加酶量為5%(酶與底物的質(zhì)量比)、酶解溫度和pH值在其最適條件，見(jiàn)表1。為水解條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解結(jié)束后，離心分離，取上清液冷凍干燥，然后檢測(cè)水解物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性，選出ACE抑制率最高的酶組合。

表1 4種蛋白酶的最適反應(yīng)條件Table 1 Optimal reaction conditions of four kinds of proteases

1.3.4 菜籽降壓肽制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以ACE抑制率為指標(biāo)，ACE抑制率越高越好，考察酶解過(guò)程中酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響。按照1.3.2節(jié)的工藝流程，配制質(zhì)量濃度為3、5、7、9、11g/100mL的菜籽蛋白，設(shè)水浴溫度50℃，加酶量為7%，以ACE抑制率為指標(biāo)，考察底物質(zhì)量濃度對(duì)降壓活性的影響；按照3%、5%、7%、9%、11%加酶量，設(shè)酶解溫度50℃，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL，以ACE抑制率為指標(biāo)，考察加酶量對(duì)降壓活性的影響；取底物質(zhì)量濃度為5g/100mL，加酶量為6%，設(shè)置酶解溫度分別為30、40、50、60、70℃，以ACE抑制率為指標(biāo)，考察酶解溫度對(duì)降壓活性的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化菜籽降壓肽制備條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)原理，設(shè)定酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量為3個(gè)因素，它們各自有3個(gè)水平。試驗(yàn)因子水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

根據(jù)表2所設(shè)計(jì)的因素及其水平，通過(guò)Design-Expert軟件采用三因素三水平的Box-Behnken 模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。

1.3.6 ACE抑制率的體外測(cè)定方法

目前血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的體外檢測(cè)方法有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色譜法[16-17]、熒光法[18-19]等。本實(shí)驗(yàn)采用紫外檢測(cè)，根據(jù)Cushman等[14]方法，按照劉志偉等[20]的測(cè)定方法稍作改進(jìn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力測(cè)定結(jié)果

各種酶活力的測(cè)定結(jié)果為：堿性蛋白酶1.0×104U/g、中性蛋白酶10.0×104U/g、胃蛋白酶0.12×104U/g、胰蛋白酶25.0×104U/g。

2.2 蛋白酶組合的篩選

蛋白酶兩兩組合對(duì)菜籽蛋白進(jìn)行分步水解后，其產(chǎn)物的ACE抑制率見(jiàn)表3。

表3 雙酶水解產(chǎn)物的ACE抑制率Table 3 Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of hydrolysates

由表3可見(jiàn)，相同條件下，蛋白酶ab組合的產(chǎn)物ACE抑制率最高，即堿性蛋白酶和中性蛋白酶組合進(jìn)行水解后，能得到較高ACE抑制率的產(chǎn)物，因此，選出堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為菜籽降壓肽制備條件優(yōu)化的酶制劑。

2.3 菜籽降壓肽制備條件的優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 底物質(zhì)量濃度的影響

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)所選取的范圍內(nèi)，底物質(zhì)量濃度5g/100mL時(shí)，產(chǎn)物對(duì)ACE抑制率為最大，達(dá)到49.11%。隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制率逐漸下降，原因可能是底物質(zhì)量濃度的增加對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用并加速了酶促反應(yīng)的逆反應(yīng)進(jìn)行。因此確定底物質(zhì)量濃度在5g/100mL。

圖1 底物質(zhì)量濃度對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of hydrolysates

2.3.2 加酶量的影響

圖2 加酶量對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of E/S on ACE inhibitory activity of hydrolysates

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)所選取的范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制逐漸增加，加酶量為5%時(shí)，ACE抑制率最大，達(dá)到48.03%，當(dāng)加酶量繼續(xù)增加的時(shí)候，產(chǎn)物的ACE抑制率逐漸下降，原因可能是酶量增加加速了酶促反應(yīng)的逆反應(yīng)進(jìn)行，使得產(chǎn)物得率下降。因此確定加酶量在6%左右。

2.3.3 酶解溫度的影響

圖3 酶解溫度對(duì)水解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysates

由圖3可知，實(shí)驗(yàn)所選取的范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)體系溫度的增加，產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制逐漸增加，酶解溫度在50～60℃時(shí)，ACE抑制率最大，達(dá)到47.43%～48.03%，原因是在55℃以下時(shí)，酶解溫度升高使得酶促反應(yīng)速率加快，超過(guò)55℃時(shí)，高溫使得酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或者失活。因此確定酶解溫度為55℃。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化菜籽降壓肽制備工藝

圖4 酶解溫度與底物質(zhì)量濃度交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between hydrolysis temperature and substrate concentration on ACE inhibitory activity of rapeseed protein

圖5 酶解溫度與加酶量交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between hydrolysis temperature and enzyme addition amount on ACEIA of rapeseed protein

圖4 ～6分別為酶解溫度和底物質(zhì)量濃度交互作用、酶解溫度和加酶量交互作用、底物質(zhì)量濃度和加酶量交互作用的響應(yīng)面和等高線的圖形，由圖4～6可知，其作用都為上凸的曲面，最高點(diǎn)均落在所選區(qū)域之中，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選擇的區(qū)域較為合適。由酶解溫度與底物質(zhì)量濃度交互作用對(duì)ACE抑制率的影響可以看出，酶解溫度在52.5～57.5℃之間，底物質(zhì)量濃度在4～6g/100mL之間時(shí)存在最高值。由酶解溫度和加酶量的交互作用對(duì)ACE抑制率的影響可以看出，酶解溫度在52.5～57.5℃之間、加酶量在5%～7%之間時(shí)存在最高值。由底物質(zhì)量濃度和加酶量的對(duì)ACE抑制率的影響交互作用可以看出，底物質(zhì)量濃度在4～6g/100mL、加酶量在5%～7%的范圍內(nèi)達(dá)到最高值。

圖6 底物質(zhì)量濃度和加酶量交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Response surface and contour plots for effect of cross-interaction between substrate concentration and enzyme addition amount on ACEIA of rapeseed protein

通過(guò)三因素三水平的Box-Behnken 模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests

根據(jù)表4結(jié)果，計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立菜籽多肽的ACE抑制率與酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量三因子的數(shù)學(xué)回歸模型，應(yīng)用Design-Expert軟件得到編碼空間三元二次函數(shù)模型為：ACE抑制率Y=50.23－0.29A＋0.48B＋0.70C－0.12AB－1.11AC＋1.42BC－9.41A2－2.46B2－3.83C2

對(duì)上述模型試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差檢驗(yàn)Table 5 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

由表5可知，模型F值檢驗(yàn)表明顯著，失擬項(xiàng)的F值為4.22，檢驗(yàn)不顯著，表明擬合程度明顯，模型的預(yù)測(cè)值接近實(shí)際值，進(jìn)一步說(shuō)明該方程是顯著的，此試驗(yàn)方法可靠。因此，可用該回歸模型進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。

同時(shí)，由于表5中P＜0.0500 的對(duì)應(yīng)項(xiàng)為模型影響顯著項(xiàng)，因此，本模型中C、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響顯著。對(duì)比酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量三者的F值也能看出，加酶量的影響最大，其次為底物質(zhì)量濃度，酶解溫度影響最小。

對(duì)函數(shù)進(jìn)行分析，得到A=－0.02、B=0.13、C=0.12，此時(shí)ACE抑制率最大，最大值為50.303%，即最優(yōu)的水解條件為酶解溫度54.9℃、底物質(zhì)量濃度5.65g/100mL、加酶量6.5%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下制備出菜籽降血壓肽的ACE抑制率為50.12%，接近于理論值。

3 結(jié) 論

通過(guò)Box-Behnken模型響應(yīng)面法優(yōu)化菜籽降壓肽制備工藝，得到了酶解菜籽蛋白質(zhì)的回歸方程為ACE抑制率Y=50.23－0.29A＋0.48B＋0.70C－0.12AB－1.11AC＋1.42BC－9.41A2－2.46B2－3.83C2，通過(guò)對(duì)方程進(jìn)行求解最值，得到了最優(yōu)的水解條件為酶解溫度54.9℃、底物質(zhì)量濃度5.65g/100mL、加酶量6.5%，ACE抑制率最大值為50.303%。在優(yōu)化出的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制備出ACE抑制率為50.12%的菜籽降血壓肽，實(shí)際值接近于理論值，可以用于生產(chǎn)指導(dǎo)。

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