微波協(xié)同輔助復(fù)合酶法制備高F值玉米肽條件的優(yōu)化

張艷榮，楊 羿，宋春春，王大為*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是生產(chǎn)玉米淀粉、淀粉糖或酒精的副產(chǎn)物[1-2]。玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白68%、谷蛋白22%[3]，還有少量的球蛋白與白蛋白，其蛋白質(zhì)的含量高達(dá)67%，此外還含有15%的淀粉及少量的酯類物質(zhì)及纖維素[4]。目前我國年產(chǎn)玉米蛋白粉21萬t，主要用于飼料生產(chǎn)，附加值很低，未充分發(fā)揮玉米的經(jīng)濟(jì)價值[5]。以玉米蛋白粉為原料制取多肽可以提高玉米的綜合利用價值，延長玉米產(chǎn)業(yè)鏈，為玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展作出貢獻(xiàn)。微波輔助提取技術(shù)是近些年來逐漸興起的一項新技術(shù)，具有高效、快速、安全、節(jié)能等特點[6-8]。微波作用于物料時，穿透介質(zhì)到達(dá)物料的內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)部吸收微波能迅速升溫，使其內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁膨脹承受能力，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出，在較低的溫度條件下即可溶于介質(zhì)中，參與化學(xué)反應(yīng)。微波熱效率高，升溫時間短，在較短的時間內(nèi)即達(dá)到所需反應(yīng)溫度，提高生產(chǎn)效率[9-12]。另外，微波處理可在較高濃度條件下進(jìn)行，減少用水量，降低目的物濃縮負(fù)擔(dān)。目前制取玉米肽的方法主要是酸水解、堿水解、酶水解[13]，在低于酶失活溫度條件下直接進(jìn)行微波輔助酶解，目前尚未有報道，微波對酶特性的影響也有待于進(jìn)一步研究。本研究在微波環(huán)境下進(jìn)行酶解處理制取高F值玉米肽的酶解條件，為提高蛋白酶解效率和玉米肽F值，節(jié)能減排生產(chǎn)方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉 長春大成新資源集團(tuán)有限公司；牛血清白蛋白(生化試劑) 中國世惠生化試劑有限公司；Alcalase 2.4L蛋白酶(酶活力為386408U/mL)、木瓜蛋白酶(酶活力為795639U/g) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉(均為分析純)北京化工廠；硫酸銅(分析純) 沈陽市新西試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

NN-J993微波爐 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計 上海普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3BW型電腦數(shù)顯酸度計 上海里達(dá)儀器廠；KDC-1042型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；101A-2E型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

原料預(yù)處理→玉米蛋白粉脫脂除雜處理→調(diào)節(jié)pH值→微波協(xié)同Alcalase 2.4L蛋白酶酶解→滅酶活→迅速冷卻→離心分離→上清液→調(diào)節(jié)pH值→微波協(xié)同木瓜蛋白酶酶解→滅酶活→迅速冷卻→冷凍干燥→高F值玉米肽

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將玉米蛋白粉按照蛋白粉與水1∶5(m/V)的比例加入20℃的清水，攪拌均勻后靜置分層，測定洗滌液的pH值。棄去上清液并反復(fù)洗滌至洗滌液為中性。所得的濕玉米蛋白粉在2000r/min的條件下離心脫水處理15min，使其含水量在30%以下，其主要成分為不溶于水的醇溶蛋白，常溫放置2～4d亦不會發(fā)生腐敗變質(zhì)，同時為防止熱干燥導(dǎo)致玉米蛋白變性，影響玉米肽的制備，所以將其置于相對濕度不大于70%的室溫條件下自然放置，并經(jīng)常翻拌，晾至含水量低于12%，粉碎并篩分得到可通過0.147mm孔徑篩的經(jīng)潔凈處理的玉米蛋白粉備用。

1.3.2.2 玉米蛋白粉脫脂除雜處理

采用超臨界CO2萃取技術(shù)對預(yù)處理以后的玉米蛋白粉進(jìn)行脫脂除雜處理[14]，處理條件為壓力20MPa、溫度45℃、時間160min。處理后的玉米蛋白粉為淺黃色，無異味，含脂率1.0%以下。

1.3.2.3 高F值玉米肽制備

Alcalase 2.4L蛋白酶酶解，酶解液100℃水浴10min滅酶處理，然后迅速冷卻至室溫，3500r/min的條件下離心分離15min，得上清液，調(diào)pH值，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液100℃水浴10min滅酶處理，迅速冷卻，冷凍干燥即為高F值玉米肽[15-17]。

1.3.3 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解條件的單因素試驗設(shè)計

采用Folin-酚法對Alcalase 2.4L蛋白酶酶解的上清液中的多肽含量進(jìn)行測定[18]，并按式(1)計算多肽轉(zhuǎn)化率。

1.3.3.1 微波時間對多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在300W微波功率條件下(溫度不超過60℃)，底物含量9g/100g、pH9.0、酶添加量3g/100g時，考察微波時間為1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5min對多肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3.2 酶添加量對多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在300W微波功率條件下，底物含量9g/100g、pH9.0、微波時間2.5min時，考察酶添加量為2、3、4、5、6g/100g對多肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3.3 底物含量對多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在300W微波功率條件下，酶添加量3g/100g、pH9.0、微波時間2.5min時，考察底物含量為7、8、9、10、11g/100g對多肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3.4 pH值對多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在300W微波功率條件下，底物含量為9g/100g、酶添加量3g/100g、微波時間2.5min時，考察pH值為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0對多肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.4 木瓜蛋白酶酶解條件的單因素試驗設(shè)計

蛋白酶酶解過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，酶解程度越大，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)越多，溶液的pH值越小，用堿液滴定時耗堿量就越大。本研究使用0.1mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定，記錄與酶解前溶液pH值相同時所消耗的堿液體積，并以其為考察指標(biāo)，衡量酶解程度。

1.3.4.1 微波時間對耗堿量的影響

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、pH7.5、木瓜蛋白酶的酶添加量4g/100g，考察微波時間為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5min時耗堿量的變化情況。

1.3.4.2 酶添加量對耗堿量的影響

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、pH7.5、微波時間5min，考察木瓜蛋白酶的酶添加量為3、4、5、6g/100g時耗堿量的變化。

1.3.4.3 pH值對耗堿量的影響

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、微波時間5min、木瓜蛋白酶的酶添加量4g/100g，考察pH值為7.0、7.5、8.0時耗堿量的變化情況。

1.3.5 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確配制250μg/mL牛血清蛋白溶液，精確量取不同體積溶液，配制成不同質(zhì)量濃度，測定其在500nm波長處的吸光度，繪制牛血清蛋白濃度與500nm波長處吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，運用Excel軟件進(jìn)行線性回歸擬合，得到線性回歸方程為y=1.2995x+0.0588，相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，相關(guān)性良好。

1.3.6 分子質(zhì)量的測定

采用不連續(xù)SDS-PAGE[19-20]，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，電極緩沖液含0.5mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸(電泳級，pH8.3)，0.1% SDS(pH8.3)。電泳用樣品溶解液(含2% SDS、5%巰基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚藍(lán)及濃度為0.05mol/L、pH6.8的Tris-HCl緩沖液)上樣量為10μL，開始電泳時電壓為100V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120V，使用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色。

1.3.7F值的測定

根據(jù)玉米肽的氨基酸組成，分別計算支鏈氨基酸總量及芳香族氨基酸總量，并按式(2)計算F值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 微波時間對多肽得率的影響

圖1 微波時間對多肽得率的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on the yield of polypeptide

微波熱效應(yīng)方式與傳統(tǒng)的水浴加熱明顯不同，是通過高頻變化的電場使分子內(nèi)部極性分子進(jìn)行劇烈的運動，產(chǎn)熱快、升溫快，極短時間即可達(dá)到酶解反應(yīng)溫度。由圖1可知，以160mL水為溶劑，在微波功率為300W的條件下，微波時間為1.5～2.5min時，多肽得率隨著時間的延長而增加，當(dāng)微波時間為2.5min時，多肽得率達(dá)到最大值，超過2.5min時，多肽得率隨著時間的延長而降低。微波時間過短，體系不能達(dá)到酶解作用的最適溫度，使得酶對玉米蛋白粉的降解作用不充分，導(dǎo)致玉米蛋白粉的水解度過低，影響多肽得率；微波時間太長，反應(yīng)體系溫度過高，導(dǎo)致部分酶失活，同樣使得玉米蛋白粉的水解度過低，影響多肽得率。

2.1.2 酶添加量對多肽得率的影響

由圖2可知，當(dāng)酶添加量為3g/100g 時多肽得率達(dá)到最大值，此時玉米蛋白粉的水解度達(dá)到最大，多肽得率最高。但隨著酶添加量的增加，多肽得率不再增加，甚至出現(xiàn)了小幅度降低。目前在微波環(huán)境下酶對底物的作用機(jī)理尚不明確，可能由于酶含有極性基團(tuán)，過多的酶在微波場的高頻振蕩作用下，產(chǎn)生熱作用和機(jī)械作用，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失活，進(jìn)而使得多肽的得率有所降低。

圖2 酶添加量對多肽得率的影響Fig.2 Effect of alcalase amount on the yield of polypeptide

2.1.3 底物含量對多肽得率的影響

圖3 底物含量對多肽得率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of polypeptide

由圖3可知，底物含量為7、8、9g/100g時，酶解上清液中的多肽得率均為最大值，當(dāng)?shù)孜锖坷^續(xù)增大時，由于玉米蛋白粉的含量增多，使得玉米蛋白粉不能全部與酶的活性中心充分結(jié)合，造成了底物浪費，降低了酶解效率，導(dǎo)致多肽的得率降低。而當(dāng)?shù)孜锖恐饾u降低時，多肽得率沒有變化，但從溶劑的角度考慮，相同量的溶劑處理的玉米蛋白粉相應(yīng)減少，造成了溶劑浪費，因此以9g/100g作為酶解反應(yīng)的最佳底物含量。

2.1.4 pH值對多肽得率的影響

圖4 pH值對多肽得率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of polypeptide

由圖4可知，在pH值為9.0～9.5時，酶解上清液中的多肽得率達(dá)到了最大值，pH值過高或過低都將影響酶的活性，影響酶解效率。

2.1.5 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解條件的正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對影響多肽得率的4個因素微波時間、底物含量、酶添加量、pH值進(jìn)行L9(34)正交試驗，確定最佳的酶解條件。由表1可知，各因素對微波酶解效果影響程度的大小順序為C＞D＞A＞B，最佳工藝條件為A1B3C3D2。經(jīng)實驗驗證，A1B3C3D2組合條件下制備玉米肽得率為22.73g/100g CGM，低于表1中7號試驗結(jié)果，所以選擇7號A3B1C3D2為最佳條件，即在微波功率300W、微波時間2.5min、酶添加量3g/100g、底物含量9g/100g、pH9.0，按此條件微波酶解上清液中多肽得率最高為23.80g/100g CGM。

表1 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果分析Table 1 Result analysis of orthogonal tests for optimizing alcalase hydrolysis conditions

2.1.6 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解條件正交試驗結(jié)果的方差分析

表2 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis for orthogonal tests for optimizing alcalase hydrolysis conditions

由表2可知，pH值和微波時間對多肽得率的影響極顯著(P＜0.01)，底物含量與酶添加量對多肽得率的影響顯著(P＜0.05)。

2.2 木瓜蛋白酶酶解的條件優(yōu)化

2.2.1 微波時間對耗堿量的影響

由圖5可知，取60mL酶解上清液，在100W功率條件下，微波時間為3.5～5.0min時，耗堿量隨著時間的延長而增加，當(dāng)微波時間為5.0min時，耗堿量達(dá)到最大值，當(dāng)時間大于5.0min時，耗堿量隨著時間的延長而降低。微波時間太短，體系能量過低，不能達(dá)到酶的最適溫度，導(dǎo)致多肽與木瓜蛋白酶的作用不充分，影響酶解效率；而微波時間太長，則導(dǎo)致體系能量過高，部分酶分子失活。因此，木瓜蛋白酶的最佳微波輔助酶解時間為5.0min。

圖5 微波時間對耗堿量的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on the consumption of alkali

2.2.2 酶添加量對耗堿量的影響

圖6 酶添加量對耗堿量的影響Fig.6 Effect of papain addition amount on the consumption of alkali

由圖6可知，隨著酶添加量增加，耗堿量逐漸增加，當(dāng)酶添加量超過4g/100g后，隨著酶添加量的增加耗堿量變化不明顯。故木瓜蛋白酶最佳的酶添加量為4g/100g。

2.2.3 pH值對耗堿量的影響

圖7 pH值對耗堿量的影響Fig.7 Effect of pH on the consumption of alkali

由圖7可知，pH值為7.5時，耗堿量達(dá)到最大值， pH值過高或過低都將嚴(yán)重影響酶的活性，影響酶解效率。故使用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解的最佳pH值為7.5。

2.2.4 木瓜蛋白酶酶解條件的正交試驗設(shè)計

表3 木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果分析Table 3 Result analysis of orthogonal tests for optimizing papain hydrolysis conditions

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對影響耗堿量的3個因素微波時間、酶添加量、pH值進(jìn)行L9(34)正交試驗，確定最佳的酶解條件，由表3可知，對木瓜蛋白酶微波酶解效果影響程度大小順序為A＞B＞C，最佳工藝條件為A3B3C3。而正交表中最佳試驗號為6號，進(jìn)行A3B3C3驗證重復(fù)實驗，得此條件下耗堿量為6.23mL/100mL，與6號試驗A2B3C1相比無明顯優(yōu)勢，且消耗更多堿與酶，增加成本，因此本研究采用較經(jīng)濟(jì)的條件A2B3C1，即酶添加量4%、pH7.5、微波功率100W、微波時間5min，此條件下耗堿量最大。

2.2.5 木瓜蛋白酶酶解條件正交試驗結(jié)果的方差分析

表4 木瓜蛋白酶酶解條件正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis for orthogonal tests for optimizing papain hydrolysis conditions

由表4可知，pH值對耗堿量的影響極顯著(P＜0.01)，微波時間與酶添加量對耗堿量的影響顯著(P＜0.05)。

2.3 微波協(xié)同酶解與傳統(tǒng)水浴酶解的比較

2.3.1 酶解時間的比較

表5 兩種方法酶解時間的比較Table 5 Comparison of hydrolysis time for both methods

由表5可知，以Alcalase 2.4L蛋白酶進(jìn)行傳統(tǒng)水浴加熱酶解時，反應(yīng)60.0min后的多肽得率與在微波協(xié)同酶解反應(yīng)2.5min后的得率相近，未有明顯升高。以木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解時間40min后的耗堿量為6.25mL/100mL，與微波協(xié)同酶解5min后的耗堿量相近。因此使用微波協(xié)同酶解方法對玉米蛋白粉進(jìn)行酶解，反應(yīng)時間明顯縮短，大大降低了反應(yīng)的能耗，同時還能保證酶解效率，是一種節(jié)能而高效的新型酶解方法。

2.3.2 氨基酸組成的比較

圖8 水浴酶解后多肽的氨基酸圖譜Fig.8 Amino acid profile of corn peptide prepared by traditional water-bath enzymatic hydrolysis

圖9 微波協(xié)同酶解后多肽的氨基酸圖譜Fig.9 Amino acid profile of corn peptide prepared by microwaveassisted enzymatic hydrolysis

按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》計算氨基酸的含量，結(jié)果見表6。

表6 多肽氨基酸組成的比較Table 6 Comparison of amino acid compositions in corn peptide

對比兩種方法制得的玉米肽的氨基酸組成，可以看出，微波協(xié)同酶解后玉米肽F值較傳統(tǒng)水浴酶解后F值提高4.71，增加幅度達(dá)21%。

2.4 高F值玉米肽SDS-PAGE電泳圖譜

圖10 玉米肽的SDS-PAGE電泳Fig.10 SDS-PAGE of corn peptide

由圖10中的譜帶可知，在本研究條件下，采用微波輔助復(fù)合酶法制取的高F值玉米肽分子質(zhì)量為6～10kD。欲獲得更小分子質(zhì)量的短肽，還需進(jìn)一步探索相應(yīng)的實驗條件。

3 結(jié) 論

采用微波協(xié)同酶解方法制取高F值玉米肽，進(jìn)行分步酶解，第一次酶解：Alcalase 2.4L蛋白酶最佳酶解條件為底物含量9g/100g、酶添加量3g/100g、pH9.0、微波功率300W、微波時間2.5min，按此條件酶解多肽得率23.80g/100g CGM。第二次酶解：木瓜蛋白酶酶解的最佳條件為酶添加量4g/100g、pH7.5、微波功率100W、微波時間5min，按此條件進(jìn)行酶解，耗堿量為6.22mL/100mL。使用微波協(xié)同酶法所制取的玉米肽F值為27.15，比傳統(tǒng)的水浴酶法提高了21%，且極大地縮短了反應(yīng)時間，簡便快捷，不但條件溫和、容易控制、加快反應(yīng)速率，同時大幅度提高產(chǎn)物的F值，具有較好的應(yīng)用前景。

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