人泛素－核糖體蛋白27a原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)＊

曾 濤，何 德（廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞 523808）

泛素－核糖體蛋白S27a（UBRPS27a）是泛素和核糖體蛋白的融合蛋白，由RPS27A基因編碼[1]。核糖體蛋白S27a（RPS27a）為核糖體40S亞基組成蛋白之一，除參與蛋白質(zhì)合成外，還具有其他重要功能。RPS27A基因在多種活性增殖細(xì)胞中高度表達(dá)，其過表達(dá)是肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的典型特征，很可能是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤組織的標(biāo)志物，但其在腫瘤細(xì)胞中的功能作用及其分子機(jī)制尚未清楚[2－5]。本研究以原核系統(tǒng)表達(dá)人UBRPS27a，旨在為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達(dá)載體pGEX4T－1、人急性早幼粒細(xì)胞白血病HL－60細(xì)胞株、大腸埃希菌JM109及BL21（DE3）由廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所保存。Taq DNA聚合酶、限性內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ、DNA T4連接酶、DL2000 DNA分子標(biāo)記物、λHindⅢ標(biāo)記物、載體PMD18－T購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄（RT）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR，RT－PCR）試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 RPS27A基因cDNA全長(zhǎng)克隆 根據(jù)人RPS27A基因cDNA序列（GenBank NM＿002954）以及pGEX4T－1載體上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物P1（5′－CGC GGA TCC ATG CAG ATT TTC GTG AA－3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）及下游引物P2（5′－TCC CCC GGG TTA CTT GTC TTC TGG TTT G－3′，下劃線部分為SmaⅠ酶切位點(diǎn)），由上海生工公司合成。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL－60細(xì)胞，TRIzol試劑抽提總RNA，Oligo dT18引物反轉(zhuǎn)錄合成RPS27AcDNA第1鏈；以P1和P2為引物，RT－PCR擴(kuò)增RPS27A編碼區(qū)cDNA片段全長(zhǎng)，擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃5min，94℃45s、52℃1min、72℃1min循環(huán)35次，72℃10min，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果并拍照；將膠回收法純化的目的片段與PMD18－T載體進(jìn)行T／A克隆重組，挑選單克隆菌落，PCR鑒定陽(yáng)性克隆送上海生工公司測(cè)序；用質(zhì)粒提取試劑盒抽提經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證克隆正確的質(zhì)粒DNA（TRPS27A）。

1.2.2 pGEX4T－1－RPS27A重組質(zhì)粒構(gòu)建 以BamHⅠ和SmaⅠ對(duì)T－RPS27A質(zhì)粒和pGEX4T－1載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離；膠回收法純化的目的基因DNA片段與線性載體DNA片段在T4連接酶作用下連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)菌；挑取單克隆菌落接種于含氨芐西林（Amp＋）LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，PCR與雙酶切法鑒定后將陽(yáng)性候選克隆送上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá) 以測(cè)序驗(yàn)證正確的pGEX4T1－RPS27A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21細(xì)菌，挑選單克隆菌落，PCR與雙酶切法鑒定；將含重組質(zhì)粒的BL21細(xì)菌接種于Amp＋LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌按體積比1∶30接種于新鮮LB培養(yǎng)基，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至A600約為0.5，加1mmol／L異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）培養(yǎng)4h；以冰預(yù)冷磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，超聲破碎，離心取上清進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），考馬斯亮藍(lán)R250染色后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 RPS27A基因cDNA全長(zhǎng)克隆 RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在200bp與500bp之間發(fā)現(xiàn)1條清晰DNA條帶，大小與目的基因預(yù)期片段480bp相符（見圖1）。

圖1 RPS27AcDNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 pGEX4T1－RPS27A重組質(zhì)粒酶切鑒定 PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，酶切獲得的2個(gè)片段分別與pGEX4T－1載體（4 950bp）及RPS27A目的片段（480bp）預(yù)期大小相符（見圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中插入DNA片段序列與RPS27A基因cDNA全長(zhǎng)完全一致（見圖3）。

圖2 pGEX4T－1－RPS27A重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 GST－UBRPS27a融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá) pGEX4T－1－RPS27A重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳圖出現(xiàn)了2個(gè)過表達(dá)蛋白條帶，1條與GST－UBRPS27a融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（RMM）44×103（GST、UBRPS27a的RMM分別為26×103和18×103）相符，表達(dá)效率很高，另出現(xiàn)1條RMM稍小的蛋白條帶（見圖4）。

圖3 pGEX4T1－RPS27A重組質(zhì)粒中插入DNA片段部分測(cè)序圖譜

圖4 SDS－PAGE分析大腸桿菌GST－UBRPS27a重組蛋白的表達(dá)

3 討 論

人UBRPS27a蛋白N端是泛素，C端是RPS27a，兩端結(jié)構(gòu)域在不同物種中均高度保守。RPS27a通過C4型鋅指結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，組成核糖體結(jié)構(gòu)，參與蛋白合成。RPS27a通常與泛素融合，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。泛素在核糖體合成過程中作為分子伴侶，在RPS27a進(jìn)入核糖體之前對(duì)其有保護(hù)和穩(wěn)定作用。本研究擴(kuò)增了RPS27A基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA，成功構(gòu)建了pGEX4T－1－RPS27A重組質(zhì)粒，并在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)了GST－UBRPS27a融合蛋白，為進(jìn)一步利用GST標(biāo)簽進(jìn)行UBRPS27a蛋白純化、制備其單克隆抗體及研究其結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳圖顯示除GST－UBRPS27a融合蛋白高效表達(dá)外，另有1條RMM相對(duì)較小的條帶（約30×103左右）過表達(dá)。為排除其他混雜克隆的干擾，本研究將pGEX4T－1－RPS27A重組克隆在Amp＋LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取單克隆菌落重新誘導(dǎo)表達(dá)后，依然出現(xiàn)該條帶。由此可見該蛋白條帶是特異的，考慮可能為GST－UBRPS27a融合蛋白部分降解產(chǎn)物，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

RPS27A基因的表達(dá)在多種腫瘤組織中異常升高，可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。該基因是一種早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因，在結(jié)腸癌及胃癌組織中的表達(dá)明顯高于周邊正常黏膜組織[4]。而且RPS27A基因在低分化肝癌中的表達(dá)較正常水平升高20倍以上，用RNA干擾方法沉默RPS27A基因可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞萎縮，說(shuō)明該基因與肝癌發(fā)生有關(guān)[6]。RPS27A基因在胰腺癌的癌前病變組織表達(dá)水平升高，可用于胰腺癌早期鑒別診斷。深入分析RPS27A基因與腫瘤的關(guān)系有利于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物及臨床治療靶標(biāo)。但目前對(duì)該分子在腫瘤細(xì)胞中的具體功能及分子作用機(jī)制所知尚少。蛋白激酶CK2與多種腫瘤密切相關(guān)，是目前腫瘤治療研究中的靶點(diǎn)之一[7]。黃功華等[8]采用酵母雙雜交技術(shù)篩選HL－60細(xì)胞cDNA文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，人UBRPS27a是CK2α′亞基的候選結(jié)合蛋白。但酵母雙雜交系統(tǒng)有可能存在假陽(yáng)性結(jié)果。故本研究誘導(dǎo)表達(dá)的GST－UBRPS27a融合蛋白為采用GST pull down試驗(yàn)驗(yàn)證UBRPS27a與CK2α′亞基的相互作用準(zhǔn)備了條件，也為后續(xù)研究UBRPS27a結(jié)構(gòu)與功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1]Kirschner LS，Stratakis CA.Structure of the human ubiquitin fusion gene Uba80（RPS27a）and one of its pseudogenes[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，270（3）：1106－1110.

[2]Ganger DR，Hamilton PD，Klos DJ，et al.Differential expression of metallopanstimulin／S27ribosomal protein in hepatic regeneration and neoplasia[J].Cancer Detect Prev，2001，25（3）：231－236.

[3]Mafune K，Wong JM，Staniunas RJ，et al.Ubiquitin hybrid protein gene expression during human colon cancer progression[J].Arch Surg，1991，126（4）：462－466.

[4]Wong JM，Mafune K，Yow H，et al.Ubiquitin－ribosomal protein S27agene overexpressed in human colorectal carcinoma is an early growth response gene[J].Cancer Res，1993，53（8）：1916－1920.

[5]Revenkova E，Masson J，Koncz C，et al.Involvement of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S27in mRNA degradation triggered by genotoxic stress[J].EMBO J，1999，18（2）：490－499.

[6]Fatima G，Mathan G，Kumar V.The HBx protein of hepatitis B virus regulates the expression，intracellular distribution and functions of ribosomal protein S27a[J].J Gen Virol，2012，93（4）：706－715.

[7]Trembley JH，Chen Z，Unger G，et al.Emergence of protein kinase CK2as a key target in cancer therapy[J].Biofactors，2010，36（3）：187－195.

[8]黃功華，梁景耀，陳碧，等.用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選泛素／核糖體蛋白S27a[J].癌癥，2005，24（1）：40－46.