丁香等3種揮發油對磷酸川芎嗪貼劑的促滲作用

羅紅梅，馬云淑，黃金娥，張貴華，康紹建 （.云南中醫學院藥學院，云南 昆明 650500；.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650000）

丁香等3種揮發油對磷酸川芎嗪貼劑的促滲作用

羅紅梅1，馬云淑1，黃金娥1，張貴華1，康紹建2（1.云南中醫學院藥學院，云南 昆明 650500；2.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650000）

目的：考察丁香揮發油、肉豆蔻揮發油、八角茴香揮發油對磷酸川芎嗪透皮貼劑的促滲作用。方法：以小白鼠為透皮屏障，3%月桂氮芯卓酮為陽性對照，每種揮發油分別考察3%，5%，7%的體積分數對磷酸川芎嗪透皮貼劑的經皮滲透的影響，篩選出同種揮發油的不同體積分數中5%丁香油、3%八角茴香油、3%肉豆蔻油對磷酸川芎嗪透皮貼劑的經皮滲透效果最好。采用改良Franz擴散池，以裸鼠皮膚為透皮屏障，HPLC法測定磷酸川芎嗪的累積滲透量，驗證以小白鼠為透皮屏障篩選出的最佳揮發油。結果：磷酸川芎嗪12 h的累積滲透量（Q12）大小依次為5%丁香油＞3%月桂氮芯卓酮＞陰性對照＞3%八角茴香油＞3%肉豆蔻油。5%丁香油促透效果最好，12 h的累積滲透量可達3.964 mg·cm－2，12 h增滲倍數為3.22，與陰性組相比差異有非常顯著性意義（P＜0.01），且高于陽性對照組月桂氮芯卓酮（Q12為3.056 mg·cm－2；ER12為2.23）。結論：丁香油對磷酸川芎嗪透皮貼劑的促滲作用顯著，肉豆蔻油、八角茴香油未觀察到促滲作用。

丁香油；肉豆蔻油；八角茴香油；磷酸川芎嗪貼劑；促滲作用

皮膚角質層的屏障作用是藥物透過皮膚的最大障礙，因此，尋找促進藥物透過皮膚的透皮促滲劑成為了目前透皮貼劑研究的熱點。揮發油作為天然的促滲劑，具有起效快，毒副作用小，有的甚至具有較強的藥理活性等優點［1］。從中藥中尋找新的經皮吸收促進劑正越來越引起研究者的重視。目前已有許多有關揮發油作為促滲劑的文獻報道［2］，有的揮發油促滲效果比公認的促滲劑月桂氮芯卓酮還顯著［3］。

川芎是傘形科植物川芎中最主要有效成分之一，約占生藥含量的0.2%，主要有鹽酸川芎嗪（TMPH）和磷酸川芎嗪（TMPP）兩種形式，是臨床上廣泛使用的改善微循環和腦血流的藥物，主要用于腦血栓形成脈管炎冠心病等心腦血管疾病的治療［4］。川芎嗪相對分子質量小（252.20）、熔點低且易揮發。目前常用的劑型為片劑和注射劑。藥動學研究表明，川芎嗪以口服或肌注方式給藥生物半衰期短（2.8 h），每日需頻繁給藥以維持有效血藥濃度，長期用藥十分不便。因此制成透皮吸收制劑則可彌補此缺陷。已有相關磷酸川芎嗪透皮貼劑研制的研究報道［5］。磷酸川芎嗪制備成透皮貼劑，透過皮膚的藥物量小，影響治療作用。能促進磷酸川芎嗪透過皮膚的促滲劑成為制備磷酸川芎嗪貼劑的關鍵，揮發油作為貼劑的促滲劑已有許多文獻報道。本課題在前期研究基礎上，以促滲劑月桂氮芯卓酮（氮酮）為陽性對照，選擇3種與磷酸川芎嗪有協同藥理作用的中藥揮發油：丁香、八角茴香、肉豆蔻揮發油，考察揮發油對磷酸川芎嗪體外經皮滲透的影響，篩選出最佳的揮發油促滲劑，為中藥促滲劑的研究與開發提供實驗依據。

1 材料

1.1儀器 TK－12B型透皮擴散試驗儀（上海鎧凱科技貿易有限公司）；高效液相色譜儀（四元泵，美國Agilengt 1100，二極管陣列檢測器，色譜柱：Lichrospeher TM C18（5μm，4.6×250 mm）；干燥器。

1.2 藥品與試劑 磷酸川芎嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100845-200501）；磷酸川芎嗪原料藥（上海諾泰化工有限公司，批號20090325）；Eudragit E100（德國羅姆公司，批號080301077，含量99%）；甘油（重慶川東化工有限公司）；檸檬酸三乙酯（Alfa Aesar a Johnson Matthey Company，批號10143596，含量99%）；甲醇為色譜純，水為純凈水；50%乙醇；0.9%生理鹽水。

丁香系桃金娘科番櫻桃屬植物丁香Eugenia caryophyllataThumb的干燥花蕾；八角茴香為木蘭科植物八角茴香IlliciumverumHook.f.的干燥成熟果實；肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁（云南綠生藥材有限公司，經云南中醫學院生藥教研室楊樹德教授鑒定）。

1.3 動物 裸鼠［成都達所生物科技有限公司，許可證號：SCSK （川）2008- 24；合格證號：0000717］，雌雄兼用，體質量18～22 g。

2 方法

2.1 揮發油的提取 采用水蒸汽蒸餾法提取揮發油，并通過GC-MS鑒別其成分并測定含量。結果表明丁香揮發油淡黃色油狀液體，收率為8.4%（m L·g－1），其中含有12種主要成分，以丁香酚（66.10%）、β－石竹烯（25.02%）等含量較高；肉豆蔻油為無色油狀液體，收率為4.2%m L g 其中含有13種主要化學成分，其中以香檜烯（17.60%）、α－蒎 烯 （17.56% ）、β－蒎 烯 （15.86% ）、松 油-4-醇（10.91%）等含量較高；八角茴香油為無色油狀液體，收率為3.9%（m L·g－1）其中含有12種主要化學成分，以反－茴香腦（84.49%）含量較高。

2.2 磷酸川芎嗪貼劑的制備［6］精密稱取磷酸川芎嗪、Eudragit E100等加入一定體積分數乙醇中攪拌溶解，靜置10 min，依次加入檸檬酸三乙酯等，攪拌并混合均勻，之后加入經預試驗篩選的一定體積分數揮發油，混合均勻，于頻率45 Hz的超聲儀中超聲10 min除氣泡，涂布，于40～50℃烘箱干燥2 h，取出貼上保護膜，即得含揮發油貼劑。

2.3 色譜條件［7］LichrospeherTMC18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇－水（60∶40）；檢測波長：295 nm；流速：1.0 m L·min－1；柱溫：25℃，進樣量：5μL。

2.4 系統適應性試驗及專屬性考察 分別吸取對照品溶液、樣品透過液、空白基質透過液、鼠皮透過液、含5%丁香油樣品透過液、含3%肉豆蔻油樣品透過液、含3%八角茴香油樣品透過液、含5%氮酮樣品透過液各20μL進樣，記錄色譜圖，結果見圖1。空白基質透過液、鼠皮透過液在磷酸川芎嗪峰位置處無吸收峰，對照品溶液與樣品透過液的主峰保留時間基本一致，保留時間約為5.2 min，磷酸川芎嗪峰形良好，無雜質及揮發油干擾峰。

圖1 磷酸川芎嗪的高效液相色譜圖A.5%氮酮樣品；B.3%肉豆蔻油樣品；C.5%丁香油樣品；D.3%八角茴香油樣品；E.空白基質；F.鼠皮；G.樣品；H.磷酸川芎嗪對照品溶液；1-磷酸川芎嗪峰Fig 1 HPLC chromatography puicture of ligustrazine phosphateA.5%azone sample；B.3%volatile oil of semen myristicae sample；C.5%volatile oil of Flos caryophyll sample；D.3%volatile oil of Fructus Anisi Stellati sample；E.blank matrix；F.rat skin；G.sample；H.ligustrazine phosphate reference substance solution；1-ligustrazine phosphate

2.5 線性關系的考察 精密稱取磷酸川芎嗪對照品約10 mg置于25 m L量瓶中，加0.9%的生理鹽水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液至量瓶中，用0.9%的生理鹽水稀釋至刻度，搖勻，配成質量濃度為0.02，0.06，0.12，0.24，0.40，1.10 mg·m L－1的系列溶液，分別進樣5μL，記錄色譜圖，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做線性回歸，回歸方程為：Y＝1 558X＋4.038，R2＝0.999 9，結果表明，在0.02～1.10 mg·m L－1范圍內，磷酸川芎嗪濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取質量濃度為0.12 mg·m L－1的磷酸川芎嗪對照品溶液連續進樣6次，每次5μL，測量峰面積，結果RSD為0.17%。

2.7 重復性試驗 取同一批磷酸川芎嗪透皮貼劑（批號20110402）進行體外透皮試驗，平行制備6份4 h時的樣品透過液，分別進樣5μL，測定含量，RSD為0.44%。

2.8 穩定性試驗 精密吸取磷酸川芎嗪貼劑（批號20110402）0.5 h的透過液1 m L，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣測定峰面積，進樣量為5μL，記錄峰面積，結果RSD為0.54%。

2.9 加樣回收率試驗 分別取磷酸川芎嗪貼劑（批號20110402）0.5，4，8 h的樣品透過液1 m L于10 m L量瓶中，分別加入質量濃度為0.24，1.10，0.12 mg·m L－1的標準品溶液1.0，0.5，1.0 m L用0.9%生理鹽水稀釋至刻度，搖勻，制備成低、中、高3個不同的濃度，每個濃度平行制備3份，分別進樣5μL，測定其峰面積，利用外表一點法計算含量及回收率，測得平均回收率為100.43%，RSD值為1.79%，符合藥典規定的加樣回收率試驗要求。

2.10 離體鼠皮的制備 將裸鼠處死，迅速剝取腹部皮膚，小心去除皮下脂肪等組織，然后用生理鹽水反復沖洗，直至洗液澄清為止剪成適當的大小，最后置于加入適量的0.9%的生理鹽水的燒杯中，放入－20℃冰箱中冷凍保存，一周內用完。

2.11 貼劑的體外透皮方法［8］實驗前從－20℃冰箱中取出備用鼠皮，用生理鹽水反復淋洗至洗液澄清，濾紙吸干后即固定于TK－12B型透皮擴散試驗儀的擴散池上使角質層面向上，將透皮貼劑貼于鼠皮上，接受室加滿擴散介質，以（37±0.2）℃水浴保溫磁力攪拌子，以（250±5）r·min－1的速度攪拌，分別于0.5，1，2，4，6，8，10，12 h取接收室中接收液立即補加等量的新鮮擴散介質，并排凈氣泡，接收液以0.45μm的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液進樣，測定其峰面積。

2.12 結果處理 據下式求得累積滲透量

式中Cn為第n個取樣點測得的藥物濃度；Ci為第i個取樣點測得的藥物濃度。以累積滲透量Q對時間t作圖，藥物滲透達到穩態后，其中直線部分的斜率為藥物的透皮速率，即穩態滲透速率（Jss）。藥物的滲透系數（Kp）用下式計算Kp＝Jss／C，C為供給池的藥物濃度；增滲倍數（enhancement ratio，ER），可從下式得到：ER＝Kp／Kp0，Kp為加促滲劑后藥物的滲透系數，Kp0為藥物固有的滲透系數。

3 結果

根據預試驗，以小鼠皮膚為透皮屏障，氮酮為陽性對照組，將每一種揮發油按3%，5%，7%和10%的比例篩選，確定每種揮發油的最佳濃度。最終以裸鼠皮膚為透皮屏障，驗證每種揮發油的最佳濃度。按“2.2”方法制備得空白貼劑、含3%氮酮貼劑、含5%丁香油貼劑、含3%肉豆蔻油貼劑和含3%八角茴香油5種貼劑。分別取5種貼劑，按“2.5”所述的方法進行實驗。測定接受池中皮膚透過液中磷酸川芎嗪的含量，計算其累積滲透量、滲透系數、增滲倍數等，結果見表1、圖2。

由表1和圖2可得：12 h的累積滲透量為排序為5%丁香油＞3%氮酮＞陰性對照＞3%八角茴香油＞3%肉豆蔻油。5%丁香油促透效果最好，對磷酸川芎嗪12 h的累積滲透量可達3.964 mg·cm－2，12 h增滲倍數ER12為3.22，明顯高于陽性對照組氮酮（ˉQ12為3.056 mg·cm－2；ER12為2.23），而肉豆蔻油和八角茴香油對磷酸川芎嗪未見促滲作用。

4 討論

丁香、肉豆蔻、八角茴香中均含有豐富的揮發油，揮發油中所含的萜類化合物具有一定的促滲作用。丁香油中主要成分為丁香酚，丁香酚藥理作用廣泛，具有抑菌、鎮痛麻醉、解熱、抗氧化、促進透皮吸收、祛蚊等多種藥理活性，這一成分可能是丁香油促滲作用顯著的主要原因。而肉豆蔻油和八角茴香油對磷酸川芎嗪未觀察到促滲作用，但在其他研究報道中，卻有一定促滲作用［2－3］，這可能與不同模型藥的性質及其他因素有關。

表1 3種揮發油對TMPP貼劑12 h的透皮速率及增滲倍數（±s，n＝5）Tab 1 The sequence of average through skin rate and increasing permeability multiples of the three kinds of volatile oil（±s，n＝5）

表1 3種揮發油對TMPP貼劑12 h的透皮速率及增滲倍數（±s，n＝5）Tab 1 The sequence of average through skin rate and increasing permeability multiples of the three kinds of volatile oil（±s，n＝5）

注：經t檢驗，與陰性對照組比較，差異具有非常顯著性意義b（P＜0.01）；與陰性對照組比較，差異具有顯著性意義a（P＜0.05）

促滲劑ˉQ12／mg·cm－2Q-t方程相關系數（r）Jss／mg·cm－2·h－1 91 009 8 －3%氮酮 3.056 7±0.553 1aQ＝0.2041 t＋1.032 2 0.908 1 0.204 1±0.047 0b 2.23 3%肉豆蔻 1.309 8±0.153 3 Q＝0.078 2t＋0.535 2 0.898 9 0.078 2±0.011 4 0.85 5%丁香 3.964 2±0.621 3bQ＝0.295 2t＋0.976 5 0.951 3 0.295 2±0.067 9b 3.22 3%八角茴香 1.337 6±0.430 0 Q＝0.082 6t＋0.120 5 0.995 5 0.082 6±0.037 8 0.ER陰性對照 1.447 4±0.143 3 Q＝0.091 6t＋0.601 4 0.901 8 0.091 6±0.

圖2 磷酸川芎嗪12 h累積滲透量Fig 2 The sequence of average permeation quantity（ˉQ12）of ligustrazine phosphate

貼劑在制備過程中需加熱，使貼劑中的骨架成分相互作用成型。揮發油作為促滲劑存在于貼劑中。而揮發油的性質是遇熱易揮發，為此，怎樣控制好揮發油的量，保證揮發油的促滲作用成為研究促滲劑的一大問題，有待于更深的研究。

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Enhancing effect of three kinds of volatile oils on permeation of ligustrazine phosphate patches through hairless skin mice

LUO Hong-mei1，MA Yun-shu1，HUANG Jin-e1，ZHANG Gui-hua1，KANG Shao-jian2（1.College of Pharmacy，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Yunnan Kunming 650500，China；2.Yunnan Institute for Food and Drug Control，Yunnan Kunming 650000，China）

OBJECTIVETo investigate the effect of volatile oils，which were extracted from Flos Caryophylli（FC），Semen Myristicae（SM），Fructus Anisi Stellati（FAS），on the permeation of ligustrazine phosphate（LP）patches through hairless mouse skininvitro.METHODSA test of penetration through the skin was conducted by using an improved method of Franz diffusion cells in preliminary experiments.The effect of volatile oil of FC，SM and FAS on the permeation degree of LP from the concentration of 3%，5%，7%by each volatile oil was compared with 3%azone.As a result the best enhancing effect by each volatile oil was 5%volatile oil of FC、3%volatile oil of FAS and 3%volatile oil of SM.A test of penetration through hairless skin mice was conducted by using an improved method of Franz diffusion cells.The effect of volatile oil of FC，SM and FAS on the permeation degree of LP through hairless skin mice was observed and compared with 3%azone.The content of LP was detected by using HPLC.RESULTSThe sequence of average permeation quantity（Q12）of the three kinds of volatile oil was 5%volatile oil of FC＞3%azone＞negative control＞3%volatile oil of FAS＞3%volatile oil of SM.5%volatile oil of FC had the highest enhancing effect，its average permeation quantity was 3.964 mg·cm－2，it was significantly higher（P＜0.01）than the negative group by independent-samplest-test.12 h Enhancing Rates（ER）of 5%volatile oil of FC was 3.22，it was better than 3%azone（Q12was 3.056 mg·cm－2，12 h ER was 2.23）.CONCLUSIONThe volatile oil of FC could enhance penetration of LP obviously，but the enhancing effects of volatile oil of SM and FAS were not observed.

volatile oil of Flos Caryophyllata；volatile oil of Semen Myristicae；volatile oil of Fructus Anisi Stellati；ligustrazine phosphate patchs；enhancing permeation

R285.5

A

1001-5213（2013）13-1032-04

云南省科技計劃項目（NO：2008CD152），國家自然科學基金項目（NO：30960517） ［作者簡介］羅紅梅，女，碩士研究生，電話：13987664185，E-mail：lhm19851010＠163.com ［通訊作者］馬云淑，女，教授，電話：0871-5918204，E-mail：yunshuma2＠126.com

2012-10-06