鈣蛋白酶抑制劑對大鼠腦外傷后的神經保護作用分析

王勇朝 崔穎 崔建忠 張娟

鈣蛋白酶抑制劑對大鼠腦外傷后的神經保護作用分析

王勇朝 崔穎 崔建忠 張娟

目的 分析鈣蛋白酶抑制劑對大鼠腦外傷后神經的保護作用。方法 選取56只大鼠并進行分組，腦外傷后分別注射鈣蛋白酶抑制劑和生理鹽水，分析細胞凋亡情況。結果 觀察組的神經元凋亡比對照組少。結論 鈣蛋白酶抑制劑對腦外傷后的大鼠具有良好的神經保護作用。

鈣蛋白酶抑制劑；腦外傷大鼠；神經保護；凋亡

腦外傷是一種由于間接或直接作用, 使腦部出現損傷的情況。比較常見的腦外傷有顱骨骨折、頭皮裂傷、顱內血腫、腦震蕩等［1］。受傷后傷者會出現不同程度的意識模糊、嘔吐、頭痛、運動障礙等情況。顱腦損傷后腦細胞常出現凋亡的情況, 這與繼發性腦損傷的嚴重程度有密切關系。鈣蛋白酶作為腦外傷繼發性損傷中的重要組成因素之一, 通過激活caspase系統可能會對腦外傷繼發性損傷具有一定的保護作用。現采用大鼠實驗的方法進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取56只2～3個月大的健康SD大鼠作為研究對象, 所有大鼠的重量為255～290g之間, 其中雌性大鼠20例, 雄性大鼠26例。將其隨機分為觀察組和對照組, 每組28例。

1.2 方法 先給予所有大鼠注射250 mg/kg水合氯醛(10%),然后給予觀察組28例大鼠的側腦室注射10 μl鈣蛋白酶抑制劑, 給予對照組28例大鼠的側腦室注射10 μl生理鹽水。按照不同的處死時間點將每組各分為四個小組, 每小組為7例：0.5 h組、6 h組、24 h組以及3 d組。次日, 利用自由落體撞擊方式制造大鼠腦外傷(撞擊的高度為1.6 m,重量為55 g)。在各處死點觀察和記錄大鼠神經功能的缺失癥狀。

1.3 TUNEL檢測法檢測凋亡 使用多聚甲醛(4%)和生理鹽水快速灌注大鼠, 然后將大鼠的整個腦組織取出, 并將軟腦膜剝離完全。將取出的腦組織侵泡于多聚甲醛(4%)中約4 h,然后再將其撈出侵泡于5℃的蔗糖溶液(30%)中約2 d時間［2］。將固定后的腦組織進行冰凍切片(厚20 μm), 并在TUNEL試劑盒中進行蘇木素染色。最后使用400倍的光鏡觀察并記錄陽性細胞數。

1.4 統計學方法 數據的統計分析使用SPSS11.5軟件, 數據使用均數( x-±s)表示, 并使用t檢驗, 以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

TUNEL法檢測結果顯示兩組大鼠的海馬區存在不同數量的TUNEL染色陽性的凋亡細胞。觀察組中, 0.5 h組為(54±2.9)個、6h組為(56±1.0)個、24h組為 (59±2.2)個、3d組為 (66±3.1)個；而對照組相中, 0.5h組為( 66±2.4)個、6h組為( 64±1.4)個、24h組為 (68±5.6)個、3d組為 (74±2.9)個。可見, 觀察組的TUNEL陽性的凋亡細胞在不同的處死點均比對照組少, P＜0.05,差異具有統計學意義。

3 討論

Calpain系統是一種比較復雜的蛋白降解體系, 其主要的作用對象是受體蛋白、蛋白激酶、細胞骨架蛋白。通過對其進行降解, 從而將細胞分解, 使其引起凋亡。因此, Calpain的活化成為細胞凋亡的主要途徑。通過本次大鼠實驗研究, 總結鈣蛋白酶誘發細胞凋亡的可能原因有以下兩點：①啟動了Caspases介導的細胞凋亡；②Ca2+的釋出起到誘導死亡受體配體表達的作用。研究中, 給予觀察組腦損傷大鼠鈣蛋白酶抑制劑治療, 在大鼠腦外傷0.5 h能檢測到大鼠的凋亡細胞, 且凋亡細胞的數量呈逐漸上升的趨勢, 在第3 d時達到高峰, 這也與其他文獻資料中的研究結果相一致。出現此種現象的原因可能是：使用鈣蛋白酶抑制劑治療大鼠屬于一次性注射治療, 在大鼠體內的作用有限, 因此, 能在短時間內檢測到該藥物對細胞凋亡的影響作用。為此, 推測3d后再進行TUNEL法檢測, 由于藥物在大鼠體內的代謝降解作用, 濃度越來越小, 可能難以抑制鈣蛋白酶, 無法阻止細胞凋亡的進度。不過對于具體的有效時間目前仍需進一步實驗研究。通過本次研究, 證明鈣蛋白酶抑制劑對腦外傷后的大鼠具有一定的保護作用。從而能在一定程度上減少腦外傷后神經細胞繼發性損傷, 這對于鈣蛋白酶抑制劑用于治療人類的腦外傷具有十分重要的意義。

［1］ 楊瑞,羅承良,孫玉霞,等.E64d對創傷性腦損傷小鼠神經細胞的保護作用.蘇州大學學報(醫學版), 2011,31(2):183-187.

［2］ 丁可,王漢東,成慧琳,等.創傷性腦損傷后小鼠腸道Toll樣受體4的表達.腸外與腸內營養, 2010,17(04):243-246.

063000 唐山,河北聯合大學基礎醫學院(王勇朝張娟)；唐山市工人醫院神經外科(崔穎 崔建忠)

高俊玲