微管解聚蛋白Kif2a參與腦膠質細胞瘤的發生和進展

由慶軍 杜依燃

1 資料與方法

1.1 一般資料 腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤, 具有侵襲性生長, 無控性增殖, 易復發特點［1,2］。Kif2a基因定位于5q12.1上, 具有微管解聚酶的作用, 沿著微管作單向運動［3］, Nakamura［4］發現 , 在胃癌癌組織中 Kif2c的mRNA在多數原發腫瘤中的表達高于配對的癌旁組織。但驅動蛋白Kif2a在腦膠質瘤的發生發展中的作用至今尚未見報道。本研究中, 作者檢測30例原發瘤組織及相應的瘤旁標本Kif2a表達情況。結果Kif2a在原發組織中高表達, 在癌旁低表達, 并且在mRNA轉錄水平和蛋白表達水平一致。沉默Kif2a抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。因此, Kif2a有望成為腦膠質瘤早期診斷標志物。

1.2 材料

1.2.1 細胞和腫瘤標本

U87培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培養基, 于37℃、5% CO2培養至對數生長期。30例標本均取自2004～2010年吉林市中心醫院收治的腦膠質瘤細胞患者。

1.2.2 siRNA轉染 采用Lipofectamine 2000脂質體轉染質粒。分別以 100 nmol/L siRNA 和 2 μl Lipofectamine 2000各溶于50 μl培養基, 孵育5 min后混合20 min, 緩慢滴入置于500 μl OPTI-DMEM無血清培養基的細胞中, 轉染48 h后用于基因表達檢測和體外細胞學實驗。

1.2.3 RT-PCR 采用Oligo 6.0軟件設計引物, PCR 反應條件為50 ℃ 溫育2 min, 95 ℃預變性3 min, 95 ℃變性30 s,60℃退火延伸1 min, 40個循環。每個樣本均設3個副孔。△CT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差, 2-△CT則為該樣本中Kif2a相對于GAPDH mRNA的表達量。

1.2.4 Western blot Western blot依據［5］所進行

1.2.5 Transwell和MTT 將懸浮于500 μl無血清培養基的5×104個 U87-siControl、 U87-siKif2a-1和 U87-siKif2a-2細胞接種于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室, 下層加入750 μl含10%FBS的細胞培養液, 培養8 h。取出transwell小室,通過3步染色試劑盒固定、染色, 自來水漂洗3次, 室溫風干,鏡下觀察穿孔細胞數目。MTT法依據［6］所進行。

1.3 統計學方法 分別將病例分類為Kif2a mRNA高表達組和低表達組, 統計學分析用SPSS 16.0統計軟件。P< 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Kif2a在原發瘤組織和配對正常組織差異表達 檢測30例原發瘤和配對瘤旁正常腦組織病例中Kif2a mRNA和蛋白表達, 結果表明25例患者組織中Kif2a表達量較配對瘤旁正常腦組織上調3倍, 卡方檢驗證實原發組織中較配對瘤旁正常腦組織中表達差異具有統計學意義(P=0.034)。

2.2 沉默Kif2a表達以及對腦膠質瘤細胞體外生物學行為的影響 檢測U87、siControl、siKif2a-1和siKif2a-2中Kif2a mRNA和蛋白表達, 結果沉默Kif2a表達的U87細胞中Kif2a 的mRNA和蛋白表達較對照細胞均顯著下調。MTT和Transwell實驗顯示, siKif2a-1和siKif2a-2細胞的增殖、侵襲和遷移能力較對照細胞和親本細胞降低。

3 討論

Kif2a-siRNA處理人類乳腺癌細胞和用Kif2a抗體干擾的蟾蜍卵中出現單極紡錘體的形成和細胞增殖的阻斷,其功能異常可能會導致基因組不均衡, 最后腫瘤發生。Wang等［7］研究發現, Kif2a在口腔癌組織中高表達。以上研究提示,Kif2a表達與腫瘤增殖和轉移相關。Kif2a作為促癌基因, 我們推測其在腦膠質瘤中可能存在異常表達并與腫瘤細胞侵襲遷移存在相關性。目前, 對于Kif2a在腦膠質瘤惡性腫瘤中的表達及其與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移的關系研究尚未見報道。我們發現, Kif2a在原發瘤組織中表達量比配對瘤旁正常腦組織上調3倍。體外細胞學實驗發現沉默Kif2a表達,細胞的增殖、遷移和侵襲能力較對照降低。因此, 我們推斷Kif2a可作為評價腦膠質瘤預后的一個重要因子。

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