聚凝胺-微孔板法不規則抗體篩選方法的建立

任忠國

·實驗研究·

聚凝胺-微孔板法不規則抗體篩選方法的建立

任忠國

目的建立聚凝胺-微孔板法篩查獻血者不規則抗體的自動化檢測方法。方法通過對紅細胞濃度、聚凝胺試劑中各試劑量的加入比例、CUTOFF值的選擇等，確定篩查方法的最佳參數與過程。結果確定的試驗方法經實際工作檢測，準確率高、靈敏度好，并實現了操作的自動化、標準化與批量化。結論聚凝胺-微孔板法適用于血站系統對獻血者不規則抗體的大批量篩查。

聚凝胺-微孔板法；不規則抗體；批量化檢測；結果判讀標準化

對獻血者進行不規則抗體的篩查，可以避免獻血者血液中的不規則抗體輸入患者體內引起的溶血性輸血反應。目前在國內大多數血站并未采用全自動血型儀篩查獻血者的不規則抗體，采用的方法多為鹽水法、酶法、抗人球蛋白法及聚凝胺等試管法進行操作，難以進行大批量標本的檢測。2011年起，我站采用聚凝胺-微孔板法進行獻血者不規則抗體的篩查，實現了檢測標本的批量化、標準化和自動化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血標本 全部為本站獻血者的血液標本。

1.1.2儀器 AT PLUS2 全自動樣本處理系統：瑞士HAMILTON公司；

HTIII掃描酶標儀：奧地利ANTHOS公司；

Thermostar 溫育振蕩器：奧地利ANTHOS公司；

UNIVERSAL 32 平板離心機：德國；

96孔硬質U型微孔板：浙江拱東。

1.1.3試劑 聚凝胺試劑：珠海貝索生物技術有限公司；O型篩選譜細胞、抗人球蛋白試劑、抗-D血清：上海血液生物醫藥責任公司。

1.1.4LISWELL實驗室管理軟件：煙臺海深威公司。

1.2方法 96孔微孔板每孔加注獻血者血清50ul→加入篩選譜細胞30ul→加入LISS液150ul →加入聚凝胺試劑30ul→設置AT加樣儀暫停→離心(200 g)1 min→棄上清(直接棄或采用AT儀吸取)→放入振蕩混旋15 s→觀察全部凝集：試驗有效→AT儀中繼續加懸浮液50 ul→放入振蕩混旋30 s→酶標儀(620nm)掃描判讀結果。

2 結果

2.1實驗條件的選擇 ①O型篩選細胞:將購入的三支O型篩選譜細胞等體積混合，做為不規則抗體的篩選細胞。②陽性對照:IgG抗D血清(10倍稀釋)。③溫育振蕩條件的選擇:根據不規則抗體血清反應的最適溫度，設定反應溫度為37℃，選擇加入懸浮液后的振蕩時間、振幅、振蕩頻率為30 s、振幅為1、頻率為800RPM。④離心條件的選擇:根據聚凝胺試劑說明書確定離心條件為200 g，1 min。⑤掃描點數及Cutoff值的確定:根據微孔凝集反應的特點：凝集紅細胞沉集于孔底，形成鈕扣狀；未凝集紅細胞混旋后，均勻散布于孔底。所以凝集孔由孔中心向外透光率逐漸增大；而未凝集孔，整孔透光率較一致，無大的變化。根據這一特點，我們確定掃描點為除孔中心19點外的16點為掃描點(酶標儀為35點掃描)。

Cutoff值的確定：采用馮健亮[1]等研究的微板法Cutoff值符合正態分布的結論，利用數理統計方法計算得出的自動微板法Cutoff值，確定本法Cutoff值為0.36～0.50。<0.36為陰性，>0.50為陽性，介于兩者之間的為可疑標本，采用試管法以抗人球蛋白的方法確認。

2.2應用效果 自2011年3月份以來，我們共進行了近2萬人份的不規則抗體篩查工作。篩查出6例不規則抗體陽性標本，經進一步確認，全部為陽性，一次判讀陽性準確率達100%。

3 討論

不規則抗體的篩查方法有多種，如鹽水法、酶法、抗人球法、聚凝胺法以及微柱凝膠等方法[2]，這些方法各有優缺點，如鹽水法僅能檢測IgM類抗體，其他幾種方法雖能檢測出各類不規則抗體，但由于采用試管法，操作時間較長，難以批量化、自動化檢測，因此多用于抗體的鑒定。采用微孔板法進行不規則抗體篩查，也有過報導。如采用抗人球-微孔板法進行的篩查方法[3]，存在著檢測時間長，中間過程紅細胞需洗滌等。還有報導采用聚凝胺-微孔板法檢測不規則抗體，但中間過程不棄上清，直接在加入聚凝胺的LISS液中加入懸浮液，然后通過混旋振蕩來觀察結果。這種方法會因為減少一步操作而節約了檢測時間，但不可避免的會由于LISS液、聚凝胺與懸浮液之間產生的中和反應，而使檢測結果的靈敏度及特異性均會有不同程度的下降。而采用本檢測方法則可有效避免這一過程，既可使檢測時間縮短，操作過程簡便，又可保證檢測結果的準確性。

我們利用全自動酶標加樣系統建立的全自動不規則抗體篩查方法在進行了大量數據優化的基礎上，經近2萬份樣本的實際檢測，一次判讀的陽性準確性達100%。具有操作簡便，使用試劑量較少，結果判讀準確率較高，易于推廣與批量化等優點。同時在檢測方法學上，有研究表明聚凝胺-微孔板法對弱陽性IgG抗D抗體檢測的靈敏度高于試管法[4]，因此適合血站系統對大批量樣本的不規則抗體的快速篩查。

[1] 馮健亮,等. ABO血型自動微板法Cutoff值建立研究.現代檢驗醫學雜志，2003，18(4)：31-32.

[2] 高峰.輸血與輸血技術.人民衛生出版社，2003：90-95.

[3] 韓惠云,張國平,李雪英,等.自動微板法篩查獻血者不規則抗體的參數優選.中國現代藥物應用,2011，4(5)：149-150.

[4] 李鑫，葛紅衛，涂東晉,等.聚凝氨-微板法篩查不規則抗體的實驗研究.福建醫藥雜志，2007，29(5)：107-109.

117000 遼寧省本溪市中心血站