過氧化損傷及抗氧化能力時(shí)間動態(tài)變化與造血干/祖細(xì)胞衰老的相關(guān)性

耿 珊 張 琛 徐春燕 姜 蓉 王 璐 王建偉 王亞平

(重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400016)

過氧化損傷及抗氧化能力時(shí)間動態(tài)變化與造血干/祖細(xì)胞衰老的相關(guān)性

耿 珊 張 琛 徐春燕 姜 蓉 王 璐 王建偉 王亞平

(重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400016)

目的探討增齡過程中小鼠Sca-1+造血干/祖細(xì)胞(Sca-1+HSC/HPC)過氧化損傷及抗氧化能力的動態(tài)變化與其衰老的關(guān)系。方法

C57BL/6J雄性小鼠分為幼年組(3～4周齡)，青年組(2月齡)，中年組(6月齡)，中老年組(12月齡)，老年組(18月齡)。提取各組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁性吸附細(xì)胞分選法(MACS)分離純化Sca-1+細(xì)胞群，WST法檢測細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)含量，TNB顯色法檢測細(xì)胞總谷胱甘肽(GSSG+GSH)含量，WST-1法檢測超氧化物含量，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色觀察各年齡組陽性細(xì)胞百分比，造血祖細(xì)胞混合集落培養(yǎng)比較各年齡組Sca-1+細(xì)胞形成集落能力。結(jié)果總SOD活力值、GSSG+GSH含量、超氧化物含量吸光度、MDA含量、SA-β-Gal陽性細(xì)胞百分比及混合集落形成率分別在幼年組為(27.51±1.11)U/g、(28.78±0.77)μmol/L、(0.114±0.005)、(2.06±0.54)nmol/mg、(2.26±0.65)%、(8.79±0.56);青年組為(38.23±3.50)U/g、(31.48 ±2.03)μmol/L、(0.109±0.005)、(0.81 ±0.35)nmol/mg、(9.08±2.74)%、(9.48±0.74);中年組為(28.85±0.65)U/g、(47.62±4.93)μmol/L、(0.133±0.002)、(2.69±0.62)nmol/mg、(11.58±0.89)%、(5.14 ±0.89);中老年組(12.67±0.89)U/g、(25.63±1.23)μmol/L、(0.151±0.009)、(11.44±1.19)nmol/mg、(35.34±2.50)%、(1.56±0.23);老年組為(17.52±1.27)U/g、(39.10±2.19)μmol/L、(0.141±0.005)、(7.06±0.95)nmol/mg、(15.76±1.23)%、(0.98±0.50)。結(jié)論隨年齡增加Sca-1+HSC/HPC的SA-β-Gal陽性細(xì)胞百分比逐漸增高，混合集落形成能力下降，SOD活性、GSSG+GSH含量逐步降低，而超氧化物、MDA含量逐漸增加，提示在增齡過程Sca-1+HSC/HPC過氧化損傷，抗氧化能力逐漸降低是造血干細(xì)胞衰老的可能機(jī)制之一。

Sca-1+造血干/祖細(xì)胞;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽;超氧化物;丙二醛

氧化損傷理論被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一，該理論認(rèn)為機(jī)體內(nèi)具有完善產(chǎn)生和清除氧自由基的平衡體系〔1〕。由于細(xì)胞生存環(huán)境中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)等機(jī)體抗氧化酶的活性不斷下降，使得細(xì)胞內(nèi)氧自由基蓄積，細(xì)胞逐漸受到損失并最終發(fā)生衰老〔2〕。造血干細(xì)胞具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化與重建長期造血的潛能，盡管在機(jī)體衰老在過程中造血系統(tǒng)的基本成分得以維持，但造血干細(xì)胞的數(shù)量和功能逐漸降低〔3〕。本研究采用免疫磁性吸附細(xì)胞分選法分離純化不同年齡小鼠的Sca-1+造血干/祖細(xì)胞(Sca-1+HSC/HPC)，研究氧化損傷與抗損傷因素在造血干細(xì)胞自然衰老中的作用，為闡述在增齡過程中HSC/HPC衰老機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 雄性C57BL/6小鼠，重慶市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔動物合格證號:SCXK(渝)2007-0001〕。小鼠分為幼年組(3～4周齡，質(zhì)量13～16 g)，青年組(2月齡，質(zhì)量20～25 g)，中年組(6月齡，質(zhì)量35～40 g)，中老年組(12月齡，質(zhì)量39～43 g)，老年組(18月齡，質(zhì)量37～45 g)。

1.2 主要藥品與試劑 抗Sca-1+微珠試劑盒(No.130-092-529)，MiniMACS磁珠分選系統(tǒng)，MS磁珠分離柱，緩沖液(德國Miltenyi Biotech公司);總谷胱甘肽檢測試劑盒(S0052)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型P0010S)，超氧化物檢測試劑盒(S0060)，總SOD活性檢測試劑盒(WST法S0102)，脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒(S0131)，Western及 IP細(xì)胞裂解液(P0013)，細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602)，小鼠干細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)專用混合培養(yǎng)基(美國Stem cell公司)，紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 免疫磁珠分離純化Sca-1+造血干/祖細(xì)胞〔4〕頸椎脫臼處死各年齡組小鼠，取脛骨和股骨，分離提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞。按本課題組方法，采用免疫磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)(MACS)分離、純化Sca-1+造血干/祖細(xì)胞(Sca-1+HSC/HPC)，并進(jìn)行細(xì)胞活性和純度鑒定。

1.4 WST法檢測各組Sca-1+細(xì)胞總SOD活性 收集分選的各年齡組 Sca-1+細(xì)胞(每組1×106個(gè))，PBS洗滌 2次，加Western及IP細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，離心5 min。取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照總SOD活性檢測試劑盒說明加樣，450 nm波長測定吸光度，根據(jù)說明書計(jì)算出各年齡組的Sca-1+HSC/HPC每克蛋白SOD酶活力單位。

1.5 TNB顯色法檢測各組Sca-1+細(xì)胞總谷胱甘肽含量 收集分選的各年齡組Sca-1+細(xì)胞(每組1×106個(gè))，PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。按照總谷胱甘肽檢測試劑盒操作，獲得樣品在412波長測定吸光度值。根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測得的不同吸光度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組總谷胱甘肽的含量。

1.6 WST-1法檢測各組Sca-1+細(xì)胞超氧化物含量 按超氧化物檢測試劑盒說明書配制檢測工作液。收集分選的各年齡組Sca-1+細(xì)胞(每組5×104個(gè)/m l)，PBS洗滌1次，在96孔板中每孔加入200μl檢測工作液懸浮的細(xì)胞37℃孵育3 min，Biorad 550酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)在450 nm測定吸光度。

1.7 硫代巴比妥酸(TBA)法檢測各組Sca-1+細(xì)胞MDA含量收集分選的各年齡組Sca-1+細(xì)胞(每組1×106個(gè))，按脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒說明書配制檢測工作液，取細(xì)胞樣品加入到96孔板中，在532 nm測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得MDA的摩爾濃度，計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量，通過單位重量的蛋白含量來表示最初樣品中的MDA含量。

1.8 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色 分別收集各年齡組Sca-1+HSC/HPC各1×105個(gè)，按照SA-β-gal Staining Kit試劑盒方法對各組Sca-1+HSC/HPC進(jìn)行染色。染色陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，倒置相差顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分率。

1.9 各年齡組Sca-1+細(xì)胞形成造血祖細(xì)胞集落能力比較 分別取各年齡組Sca-1+細(xì)胞各4×104個(gè)細(xì)胞，加入1 ml混合集落專用培養(yǎng)基，混勻后分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板0.5 m l/孔，每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，培養(yǎng)7 d時(shí)計(jì)數(shù)各組混合集落數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，描繪各年齡組小鼠Sca-1+HSC/HPC的SOD、總谷胱甘肽、超氧化物及MDA含量變化曲線，方差分析比較不同年齡組各指標(biāo)差異，相關(guān)分析比較各檢測指標(biāo)與年齡變化有無相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 MACS分選前后Sca-1+細(xì)胞純度比較 MACS分選前Sca-1+細(xì)胞百分比為(1.02±0.19)%;MACS分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度可達(dá)(93.66±0.83)%。各年齡組分選前后Sca-1+細(xì)胞純度百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)(表1)。

表1 各年齡組分選前后Sca-1+細(xì)胞純度百分比(%，±s)

表1 各年齡組分選前后Sca-1+細(xì)胞純度百分比(%，±s)

組別 n 分選前Sca-1+細(xì)胞純度 分選后Sca-1+10 0.89±0.56 93.06±0.65青年組 10 1.08±0.74 93.26±0.89中年組 10 1.14±0.89 94.85±0.77中老年組 10 1.76±0.23 94.23±0.45老年組 10 0.98±0.50 93.76±0.321)細(xì)胞純度幼年組

2.2 各年齡組Sca-1+細(xì)胞內(nèi)總SOD活性 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組樣品總SOD活力值分別為(27.51±1.11)、(38.23 ±3.50)、(28.85 ±0.65)、(17.52 ±1.27)、(12.67±0.89)U/g。總SOD活性與月齡變化有明顯相關(guān)關(guān)系(r2=0.881 9，P ＜0.01)。

2.3 各年齡組Sca-1+細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組總谷胱甘肽的含量分別為(28.78±0.77)、(31.48 ±2.03)、(47.62 ±4.93)、(39.10 ±2.19)、(25.63±1.23)μmol/L。GSH含量變化與月齡變化有明顯相關(guān)關(guān)系(r2=0.875 4，P＜0.01)。

2.4 各年齡組Sca-1+細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞超氧化物含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組測得吸光度分別為(0.114±0.005)、(0.109±0.005)、(0.133±0.002)、(0.141 ±0.005)、(0.151±0.009)。超氧化物含量反映的吸光度變化與月齡變化有明顯相關(guān)關(guān)系(r2=0.946 4，P＜0.05)。

2.5 各年齡組Sca-1+細(xì)胞內(nèi)MDA含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組測得各組Sca-1+細(xì)胞MDA含量分別為(2.06±0.54)、(0.81±0.35)、(2.69±0.62)、(7.06±0.95)、(11.44±1.19)nmol/mg。MDA含量含量變化與月齡變化有明顯正相關(guān)關(guān)系(r2=0.955 2，P＜0.01)。

2.6 各年齡組Sca-1+細(xì)胞SA-β-Gal陽性細(xì)胞百分比 SA-β-半乳糖苷酶染色顯示陽性細(xì)胞著藍(lán)色，胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒;陰性細(xì)胞未著色。幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組的陽性細(xì)胞數(shù)逐漸升高，分別為(2.26±0.65)%、(9.08±2.74)%、(11.58±0.89)%、(15.76±1.23)%、(35.34±2.50)，各年齡組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.7 各年齡組Sca-1+細(xì)胞形成造血祖細(xì)胞集落能力比較 通過觀察得知幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組的Sca-1+細(xì)胞形成的造血祖細(xì)胞集落數(shù)量降低，集落中細(xì)胞數(shù)也逐漸減少，分別為(8.79±0.56)、(9.48±0.74)、(5.14±0.89)、(1.56±0.23)、(0.98±0.50)個(gè)/104，各年齡組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

理論上認(rèn)為3～4周齡小鼠各器官發(fā)育水平相當(dāng)于人類1～2歲即幼年水平，2月齡小鼠相當(dāng)于15～20歲即青壯年水平，6月齡小鼠相當(dāng)于40～50歲即中年水平，12月齡小鼠相當(dāng)于60歲左右即中老年水平，18月齡小鼠相當(dāng)于70歲以上即進(jìn)入老年水平。

造血干細(xì)胞損傷衰老后，其自我更新和多向分化的能力下降，表現(xiàn)為造血干細(xì)胞數(shù)量減低，增殖分化形成造血祖細(xì)胞的能力下降，后者進(jìn)一步分化形成各系成熟血細(xì)胞功能衰退，表現(xiàn)為外周血全血細(xì)胞下降，骨髓明顯收抑制，發(fā)生再生障礙性貧血。研究證明，造血干細(xì)胞衰老與老年性白血病有密切聯(lián)系，隨年齡增長，老年人急性髓性白血病(AML)逐年增高〔5〕。

SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。SOD活性通常有種屬、性別及組織特異性，不同動物的不同器官隨年齡增長，SOD活性各不同〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長造血干細(xì)胞中的SOD呈下降趨勢，整個(gè)生命中總體變化趨勢，自出生至青年達(dá)到高峰，之后出現(xiàn)緩慢降低，其趨勢與造血干細(xì)胞形成發(fā)展及衰老趨勢相一致，表明中年起造血干細(xì)胞抗氧化能力急劇下降與其衰老相關(guān)。

還原型谷胱甘肽是絕大多數(shù)活細(xì)胞中巰基的主要來源，對于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)有重要作用，并且是動物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑。本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長總谷胱甘肽呈下降趨勢，整個(gè)生命中總體變化趨勢，自出生至中年達(dá)到高峰，之后出現(xiàn)緩慢降低，其下降趨勢與造血干細(xì)胞形成及發(fā)展趨勢相一致，再次表明中老年起始造血干細(xì)胞抗氧化能力急劇下降與其衰老相關(guān)。

超氧化物通常指超氧化物陰離子O2－，是一種氧分子的自由基。在呼吸鏈中，NADPH氧化酶把電子傳遞給氧分子的時(shí)候，就會產(chǎn)生超氧化物陰離子O2－。超氧化物陰離子O2－是一種強(qiáng)氧化劑，可以由被刺激的白細(xì)胞等產(chǎn)生，從而抵御微生物的感染等。超氧化物陰離子O2－也可以導(dǎo)致氧化損傷，和許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長超氧化物呈上升趨勢，整個(gè)生命中總體變化趨勢，自出生至青年達(dá)到最低，可能是由于這一時(shí)期抗氧化能力比較強(qiáng)，之后出現(xiàn)緩慢增長，其趨勢表明中年起造血干細(xì)胞過氧化損傷急劇增高與其衰老相關(guān)。

MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用所形成的脂質(zhì)過氧化物。MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又可進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷，主要因素有:①膜脂改變導(dǎo)致膜功能障礙和膜酶的損傷;②活性氧造成脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性產(chǎn)物對酶和其他細(xì)胞成分的損傷〔7〕。本次實(shí)驗(yàn)觀察到小鼠造血干細(xì)胞MDA含量自出生后1～2個(gè)月處于低水平，2～6個(gè)月基本穩(wěn)定，自6個(gè)月開始急劇上升，表明造血干細(xì)胞脂質(zhì)氧化損傷嬰幼兒、少年、青中年程度大致相當(dāng)，自中年起始氧化損傷進(jìn)行性急劇加重。

絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進(jìn)入衰老狀態(tài)。此時(shí)細(xì)胞仍然是存活的，但細(xì)胞的基因和蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了很大改變。衰老細(xì)胞細(xì)胞通常體積變大，表達(dá)pH 6.0時(shí)有高酶活性的β-半乳糖苷酶。本次實(shí)驗(yàn)觀察到隨年齡增長小鼠造血干細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性逐漸增高，集落形成能力逐漸降低，說明造血干細(xì)胞逐漸出現(xiàn)衰老且功能逐漸出現(xiàn)下降。

綜合分析上述4項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢可以推測，隨著年齡增長，造血干細(xì)胞在長期紫外線照射、維生素缺乏、微量元素代謝紊亂、內(nèi)分泌影響、離子輻射等危險(xiǎn)因素作用下，自中年起始抗氧化能力急劇下降，導(dǎo)致氧化及抗氧化平衡關(guān)系被打破，造血干細(xì)胞氧化損傷開始急劇加重，這可能是導(dǎo)致造血干細(xì)胞出現(xiàn)衰老，導(dǎo)致老年性白血病和再生障礙性貧血的發(fā)病率增高。

1 王亞平.造血干細(xì)胞生物學(xué)及其研究方法〔M〕.北京:科學(xué)出版社，2007:322-6.

2 Zhou Y，Yang B，Yao X，etal.Establishmentofan agingmodel of Sca-1+hematopoietic stem cell and studies on its relative biologicalmechanisms〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol Animal，2010;47(2):149-53.

3 Lagasse E.Purified hematopoietic stem cells can differentiate to hepatocytes in vivo〔J〕.Nature Med，2000;6(11):1229-34.

4 耿 珊，張 琛，劉 俊，等.免疫磁性活化細(xì)胞分選方法優(yōu)化及純化后細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012;28(7):393-4.

5 王亞平.干細(xì)胞衰老與疾病〔M〕.北京:科學(xué)出版社，2009:13-4.

6 Warner HR.Superoxide dismutase，aging and degenerative disease〔J〕.Free R ad ic Biol Med，1994;17(3):249-58.

7 Yan Lu，ZHao Ke-Hao，Li L，etal.Lipid peroxidation and antioxidation in lens of aging rats〔J〕.Rec Adv Ophthalmol，2008;28(4):241-4.

The dynam ic changes of peroxidation and antioxidation in hematopoietic stem/progenitor cells aging

GENG Shan，ZHANG Chen，XU Chun-Yan，et al.
Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering，Department of Histology and Embryology，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of peroxidation and antioxidation in Sca-1+hemopoietic stem/progenitor cells of agingmice.MethodsSixty C57BL/6Jmice were divided into 3 ～4 weeks，2，6，12，18 months group，20 mice in 3 ～4 weeks group，10 mice in others.Themice were executed to wash out bone marrow.The MACSwas applied to obtain the Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells from mouse bonemarrow respectively.The TNB colour test，WST-1 method and thiobarbituric acidmethodswere used to detect total glutathione(GSSG+GSH)，superoxide dismutase(SOD)，superoxide and malondialdehyde(MDA)levels in the Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells of thesemice.The percentage of SA-β-gal positive cellswas detected by senescence-associated β-galactosidase(SA-β-Gal)staining.The ability to forming CFU-Mix was tested.ResultsThe SOD contents of Sca-1+HSC/HPC in five groups were(27.51±1.11)，(38.23±3.50)，(28.85±0.65)，(12.67±0.89)，(17.52±1.27)U/g(P＜0.01).The total glutathione contents were(28.78±0.77)，(31.48±2.03)，(47.62±4.93)，(25.63±1.23)，(39.10±2.19)μmol/L(P ＜0.01).The optical density reflected by superoxide contentswere(0.114±0.005)，(0.109±0.005)，(0.133±0.002)，(0.151±0.009)，(0.141±0.005)(P＜0.01).The MDA contents were(2.06±0.54)，(0.81±0.35)，(2.69±0.62)，(11.44±1.19)，(7.06±0.95)nmol/mg(P＜0.01).The percentages of SA-β-gal positive cells were(2.26±0.65)%，(9.08±2.74)%，(11.58±0.89)%，(35.34±2.50)%，(15.76±1.23)%.The numbers of CFU-Mix were(8.79±0.56)，(9.48±0.74)，(5.14±0.89)，(1.56±0.23)，(0.98±0.50).ConclusionsWith aging，the contents of total glutathione and SOD are decreased，the contents of superoxide and MDA are increased，which indicates that the aging procedure is related with increase of peroxidation damage and the descent of antioxidation ability in Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells.

Sca-1+HSC/HPC;Superoxide dismutase;Glutathione;Superoxide;Malondialdehyde

R329.2

A

1005-9202(2013)05-1061-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.035

國家自然科學(xué)基金課題資助(81173398，30973818，30970872)

王亞平(1956-)，男，教授，主要從事干細(xì)胞衰老研究。

耿 珊(1986-)，女，在讀碩士，主要從事造血干細(xì)胞衰老的研究。

〔2012-11-05收稿 2013-02-20修回〕

(編輯 曲 莉)